ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh :
Nama : Siti Nurlatifah
NIM : B1A017066
Rombongan : III
Kelompok : B
Asisten : Salsabila Pratiwi

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2018
 HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Sumuran

Marker

Gel agarosa

Gambar 1. Hasil Elektroforesis Rombongan III

B. Pembahasan

Elektroforesis DNA merupakan metode standar untuk memisahkan,

mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul DNA
berdasarkan perbedaan ukuran. Prinsip dasar dari elektroforesis adalah
memisahkan molekul berdasarkan muatan listrik intrinsik. Molekul-molekul
tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan
muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan
negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub
negatif (katoda). Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi
mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat (Klug
dan Cummings, 1994).
Faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA pada
proses elektroforesis menurut Wolfe (1995), yaitu:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati
gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan
molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa atau semakin padat gel yang
dibuat akan membuat semakil sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA
sehingga pergerakannya juga akan semakin lambat.
3. Bentuk molekul DNA
Urutan laju dari yang paling cepat hingga yang paling lambat adalah
dari DNA berbentuk linier, open circular dan super coil.
4. Densitas muatan
Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat
dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan maka akan semakin
cepat pergerakan molekul DNA.
6. pH atau larutan buffer elektroforesis
 Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik
sehingga akan mempercepat migrasi DNA.
7. Ampere
Semakin tinggi arus listrik maka akan semakin cepat pergerakan DNA.
8. Suhu
Semakin tinggi suhu maka akan semakin cepat menguraikan struktur
DNA. Sebaliknya, semakin rendah suhu maka struktur DNA akan menyatu
kembali.
Komponen-komponen elektroforesis juga mempunyai fungsi dan
peranan masing-masing. Mikropipet berfungsi untuk memindahkan sampel ke
sumuran gel agarosa. Microwave berfungsi untuk menghomogenkan gel agarosa
dan larutan TAE 1x. Kertas parafilm berfungsi untuk menampung loading dye.
Labu erlenmeyer berfungsi untuk wadah saat pembuatan gel agarosa. Gelas
ukur berfungsi untuk mengukur volume pada saat pembuatan larutan TAE 1x.
UV transluminator berfungsi untuk memvisualisasikan DNA yang terwarnai.
Seperangkat alat elektroforesis berfungsi sebagai tempat terjadinya
elektroforesis DNA agar DNA dapat bermigrasi. Seperangkat alat elektroforesis
terdiri dari comb yang berfungsi untuk membentuk sumuran, chamber sebagai
tempat terjadinya elektroforesis, voltase sebagai sumber listrik dan tray sebagai
cetakan agar. Sarung tangan lateks berfungsi untuk melindungi tangan agar
tidak bersentuhan langsung dengan etidium bromide yang bersifat karsinogenik
atau penyebab kanker (Birren dan Lai, 1993).
Larutan yang digunakan pada praktikum ini meliputi larutan buffer TAE
1x, akuades, larutan loading dye, dan larutan Etidium Bromid (EtBr). Larutan
buffer TAE 1x berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA
berdasarkan perbedaan kekuatan ionik, sehingga disebut larutan penyangga.
Bahan-bahan penyusun larutan TAE juga memiliki fungsi tersendiri yaitu tris-
base sebagai penyangga, glacial acetic acid berfungsi sebagai larutan elektrolit,
EDTA berfungsi untuk men-inaktivasi DNase, dan akuades sebagai pengencer
larutan TAE. Loading dye memiliki fungsi sebagai pemberat DNA agar tidak
keluar dari sumuran. Kandungan yang terdapat pada loading dye antara lain
bromophenol blue sebagai penanda jalannya elektroforesis, xylene cyalol
sebagai penanda awal elektroforesis, ficoll berfungsi sebagai pemberat dan
EDTA sebagai pen-inaktivasi DNase (Magdeldin, 2012).
 Elektroforesis memiliki 2 teknik yang menginisiasi analisis dari DNA,
yaitu elektroforesis kertas dan elektroforesis gel. Elektroforesis kertas adalah
jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang
terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi
akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan
partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,
viskositas, dan absorbsivitas zat terlarut (Greenough et al., 2015).
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan
biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955, Smithies mendemonstrasikan bahwa
gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-
protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas
ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan
membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam
(stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan
untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel
yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida (Sharma-Kuinkel, Rude
dan Fowler, 2014).
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga
12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel
Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-
akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein
dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang
luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk
memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom.
Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka
berbeda-beda (Sanderson et al., 2014).
Langkah pertama yang dilakukan pada praktikum ini adalah
mengencerkan larutan TAE 1x yang berasal dari larutan TAE 50x. Larutan TAE
50x yang digunakan sebanyak 5 ml. Kemudian ditambahkan akuades sebanyak
195 ml sehingga didapat volume larutan TAE 1x yang diinginkan yakni
sebanyak 250 ml. Takaran volume larutan diperoleh dari rumus pengenceran.
Selanjutnya, gel agarosa dibuat dengan komposisi agarosa 0,4 gram dan larutan
TAE 1x sebanyak 40 ml. Campuran tadi ditempatkan pada labu erlenmeyer
kemudian dipanaskan dalam microwave. Ketika hendak mendidih, angkat labu
erlenmeyer dari microwave dan tunggu hingga larutan agarosa dalam kondisi
hangat. Setelah larutan agarosa hangat, tambahkan Etidium Bromida (EtBr).
Selanjutnya agarosa dituang ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan
comb-nya. Sambil menunggu agar mengeras, DNA yang akan dielektroforesis
disiapkan. DNA dicampurkan dengan larutan loading dye menggunakan
mikropipet dengan perbandingan 1:5. Setelah agar mengeras, DNA dimasukkan
ke dalam sumuran yang telah terbentuk. Praktikum kali ini menggunakan DNA
marka, lambda Hind III. Langkah selanjutnya adalah merendam agarosa dalam
larutan TAE 1x pada chamber elektroforesis. Lalu penutup ruang elektroforesis
dipasang dan proses running dilakukan pada tegangan 80 volt dengan kuat arus
sebesar 400 mA selama 30 menit. Setelah itu agarosa dipindahkan dalam UV
transiluminator.
Menurut Titrawani (1996), teknik elektroforesis dapat dibedakan
menjadi dua cara, yaitu: elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul
ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan
migrasi dari makromolekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan
dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik
elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi
sebagai media penyangga yang berisi larutan penyangga. Media penyangga
yang biasa dipakai adalah gel agarosa, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas
sellulose poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis
daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu
horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal,
karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat
sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat
menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Berdasarkan hasil praktikum terlihat bahwa pita fragmen DNA yang
tersinari UV tidak menunjukkan adanya pergerakan atau migrasi sama sekali,
yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada sisi tepi gel agarose. Hal
yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya penyimpanan
untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat
sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor
yang mempengaruhi proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah
dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai
DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat
mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri.,
dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang
baik, yaitu dari suhu penyimpanan. Menurut Klug & Cummings (2002), jika
pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari
suatu produk DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan
suatu kurva regresi linier.
 DAFTAR REFERENSI

Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed Field ge Electrophoresis: A Practical Guide. San
Diego: Academic Press, Inc.
Greenough, L., Schermerhorn K. M., Mazzola, L., Bybee, J., Rivizzigno, D., Cantin,
E., Slatko, B. E., & Gardner, A. F., 2015. Adapting Capillary Gel
Electrophoresis as a Sensitive, High-through put Method to Accelerate
Characterization of Nucleic Acid Metabolic Enzymes. Nucleic Acids
Research, 44(2), pp.e15–e15.
Klug, W. S. & Cummings, M. R., 2002. Essentials of Genetics. 4th Edition. New
Jersey: Prentice Hall.
Magdeldin, Sameh. 2012. Get Electrophoresis. Principles and Basics. Croatia :
InTech Publisher. Rijeka.
Sanderson, B. A., Araki, N., Lilley, J. L., Guerrero, G. L., & Lewis, K., 2014.
Modification of Gel Architecture and TBE/TAE Buffer Composition to
Minimize Heating during Agarose Gel Electrophoresis. Analytical
Biochemistry, 22(5), pp.44-52.
Sargent, J. R. & George, S. G., 1975. Methods in Zone Electrophoresis. Poole
England: BDH Chemical LTD.
Sharma-Kuinkel, B.K., Rude, T.H. & Fowler, V.G., 2014. Pulse Field Gel
Electrophoresis. The Genetic Manipulation of Staphylococci,
1373(2), pp.117-130.
Titrawani, 1996. Biodiversiti Kodok Genus Rana Ditinjau dari Morfologi, Kariotip
dan Pola Protein di Kodya Sawahlunto, Program Pasca Sarjana. Bogor:
Institut Pertanian Bogor.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. Belmont:
Wardworth Publishing Company.