Belum Diperiksa
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam
bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi:
memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis
gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
(menggunakan prinsip dalam elektroforesis).
Cara kerja
Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR menggunakan primer mikrosatelit. Berkas (band)
mendatar merupakan sekumpulan DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan kecepatan
berbeda. Semakin pendek DNA semakin cepat bergerak.
Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase
bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase
bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan
penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda
positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel.
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom-kolom (disebut well atau "sumur") pada
sisi elektrode negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek
akan bergerak dari elektrode negatif ke arah sisi elektrode positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi
sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah.
Elektroforesis
Dari Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Jenis elektroforesis
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. [6] Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel
kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-
protein. [6] Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media. [6]
LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOL : Elektroforesis Gel Agarose
ACARA II : ELEKTROFORESIS
TUJUAN
DASAR TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis
merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi
molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di
laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF).
Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui,
molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga
di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih
dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada
medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau
kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-
molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) (Klug
and Cummings, 1994).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan
dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan
sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau
asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999).
Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di
bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA
menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama
(Campbell dkk, 2002).
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarose formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang
digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar
Biasanya, gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang lebih besar (lebih dari 200
bp) dan gel poliakrilamida digunakan untuk fragmen kecil (kurang dari 200 bp). Jarak antara dua
fragmen DNA yang berbeda ukuran dapat ditentukan berdasarkan konsentrasi matriks agarose.
Mobilitas/pergerakan DNA relatif tergantung pada faktor-faktor tertentu, terutama pada konsentrasi
agarosa dalam gel, kekuatan arus yang digunakan, kekuatan ionik dari larutan buffer, dan
konformasi fragmen DNA itu sendiri. Molekul DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk
dalam padatan gel agarosa. Secara umum, molekul yang lebih kecil bergerak lebih cepat dan
bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang lebih rendah saat bergerak
menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel agarosa memberikan resolusi yang lebih
baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara band yang secara
ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain, dapat mengurangi
kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi pemisahan yang lebih
baik pada fragmen DNA kecil (Lee & Bahaman, 2010).
Namun, fragmen yang lebih besar dapat bermigrasi secara lebih cepat daripada fragmen yang lebih
kecil, karena tegangan pada gel yang ditingkatkan. Selain itu, DNA memiliki muatan yang konsisten
untuk rasio massa, sehingga ukuran molekul DNA merupakan faktor utama yang mempengaruhi
migrasi melalui matriks gel. Terlepas dari kenyataan bahwa penerapan tegangan tinggi dapat
meningkatkan kecepatan migrasi fragmen DNA, tetapi juga dapat menurunkan resolusi pemisahan
(di atas sekitar 5 sampai 8 V/cm). Untuk alasan itu, resolusi terbaik dari fragmen yang lebih besar
dari 2 kb dicapai dengan menerapkan tidak lebih dari 5 V/cm pada gel (Lee & Bahaman, 2010).
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat
karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya
fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai
pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel (Birren and Lai, 1993).
Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR,
memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga
untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam
kegiatan, antara lain membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan
sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab
kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau
jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau
aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat
molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau
mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa
fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik
antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA
(Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).
Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau
identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena lama
pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu, kadang kadang
hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary bands) atau pita yang
terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan, 2011).
ALAT
1. DNA Marker
2. Produk DNA
3. Ethidium Bromide (EtBr)
4. dd H2O
5. Gel Agarose
6. Loading Buffer (Loading dye)
7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
8. Akuades
CARA KERJA
Elektroforesis
Dokumentasi
1. Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama ± 15 menit.
2. Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama ± 15 menit.
3. Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.
HASIL
PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu
untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode
elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara mengukur
fragmen DNA pada praktikum ini.
Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan
ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu
medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
(Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal
maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:
1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel
tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau
poliakrilamid
(Biosciences, 1999).
Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan
menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan
pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA.
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung, sampel
dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong
plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang
dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode
ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran
sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan tidak
melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara umum,
proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa dengan
larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya dituangkan ke
dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai mengeras. Bubuk agarose
yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE (Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL
yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan
ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan
dilakukan penambahan running buffer. Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan
mempermudah pengerasan gel saat dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi
membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4µl dan
juga larutan marker 1kb sebanyak 3µl pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel. Sedangkan
untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses pemindahan
dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar campuran DNA
dengan loading buffer tidak “meluber” ke bagian well yang lain. DNA memiliki muatan negatif (DNA
mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai
acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang
elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi.
Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda
pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut
memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993;
Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik
untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus
sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan listrik
dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA yang besar
akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil (Magdeldin, 2012). Gel
agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna.
Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).
Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil
elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk
meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan
pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahap-tahap
tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.
Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil elektroforesis.
Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV berfungsi menerangi
bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil elektroforesis dan komputer
berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software (Davis dkk, 1994).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari
molekul DNA, yaitu:
1. Ukuran Molekul DNA
Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan
dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2. Konsentrasi gel
Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati
molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang
berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran
yang lebih besar.
3. Bentuk molekul
Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang
berbentuk bulat.
4. Densitas muatan
Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi
akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5. Pori-pori gel
Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6. Voltase
Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi
DNA
(Wolfe, 1993).
Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan
adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA pada
sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya
penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat sedikit
kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi proses
elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin untuk tidak
bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain yang dapat
mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa begitu,
dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu
penyimpanan.
Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk DNA.
Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.
KESIMPULAN
1. Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis
elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.
2. Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika
dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks
membran gel agarose.
3. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat
didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap
elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi
linier.
4. Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel adalah
ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel, voltase,
dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai yang
mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor
ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut
sebelumnya disimpan.