I.

DASAR TEORI

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan

atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini
dapat digunakan dengan memanfaatkann muatan listrik yang ada pada makro
molekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang
bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium misalnya gel agarose,
kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan
muatannya, maka molekuk tersebut akn bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio)
muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA,
maupun protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis
fragmen-fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim retriksi. Fragmen
molekul DNA yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya
dengan cara membuat gel agarose, yaitu suatu bahan semi-padat berupa
polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarose dibuat dengan
melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik, larutannya
dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikro
(microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan berupa cairan sehingga
mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya terbuat dari
Perspex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat
lubang–lubang dengan menggunakan lemabaran Perspex tipis yang dibentuk
menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancap pada salah satu ujung gel yang
masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil
terbentuklah lubang-lubang kecil. Ke dalam lubang-lubang kecil itulah
sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarose yang sudah terbentuk
kemudian dimasukan ke dalam suatu tanki yang berisi buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya
dengan Tris-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).
Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan.
Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif,
sedangkan kutub lainnya positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka
molekul-molekul DNA akan bergerak ke arah kutub positif. Setelah
beberapa waktu gel kemudian direndam dalam larutan yang mengandung
Etidium Bromida. Etidium Bromida akan menginterkalasi (menyisip ke
dalam) DNA. Penggunaan Etidium Bromida dimaksudkan untuk membantu
visualisasi karena Etidium Bromida akan memendarkan sinar ultraviolet.
Jika gel disinai dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra
berupa pita-pita pada gel. Pita-pita tersebut adalah molekul-molekul DNA
yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesis. Molekul RNA dapat
 dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu menggunakan gel agarose, namun
dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang mengandung
formaldehid. (Yuwono, 2005)
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencega terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga
yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat elektroforesis
yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH
dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada
dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan
bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai
dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan
muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan
bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika
sistem koloid bermuatan negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode
positif
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya
pengaruh medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya
Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik. Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang
bermuatan ke salah satu elektroda. Elektrotoresis dapat digunakan untuk
mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid berkumpul di elektroda
positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di
elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif. Prinsip elektroforesis
digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell.
Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE), Prinsip:
Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan
melalui suatu medan elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan
untuk protein ialah elektroforesis zonan (zonal electrophoresis) di mana protein
dipisahkan dari satu campuran yang kompleks kepada jalur (band) melalui
migrasi didalam larutan penimbal berair melalui satu matrik polimer dipanggil
gel. Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim didalam
elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga
digunakan. Matrik gel boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca atau keping
(slab) diantara dua kepingan kaca.
Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI
nya. Suatu protein bercas negatif sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala
suatu protein itu bercas positif sekiranya pH larutan dibawah pI nya. Banyaknya
cas dan voltan yang diberikan akan menentukan berapa jauhnya suatu protein
itu akan bergerak didalam suatu medan elektrik. Semakin tinggi voltan dan
semakin besar cas yang terdapat pada protein, maka semakin besarlah
pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan bentuk molekul yang menentukan
jejari Stokes suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan didalam matrik
gel tersebut. Pergerakan protein perlahan apabila pergeseran molekul meningkat
akibat dari mertambahnya jejari Stokes; dengan demikian, protein yang lebig
kecil bergerak lebih pantas didalam matrik gel. Bagitu juga, pengurangan dalam
saiz liang (pore) matrik gel akan memperlahankan pergerakan.
Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis
natif, protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk
molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi
pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel
poliakrilamid dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat digunakan
untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam
suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,
merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan
menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu
bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan
molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri
massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan
metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis gel merupakan suatu
teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan
biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi:
memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam
elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan
muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis)

Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga: Jakarta

Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group