Oleh :
Alfi Syahrul Miftahul Huda| 11420030
Asisten :
Hariza Fazari | 21320007
Erlenmeyer Agarose
C. Running Elektroforesis
Gel Agarosa
Diletakkan gel pada cetakan elektroforesis & ditunggu hingga mengeras
Dilepas cetakan sumur secara perlahan
Diletakkan gel dan cetakannya pada tangki elektroforesis
Dituang TAE Buffer 1x sebanyak 400 mL hingga seluruh permukaan gel
terendam
Ditempatkan parafilm bening bersih pada meja di depan alat elektroforesis
Direkatkan pinggirannya dengan selotip
Sampel Isolasi DNA/PCR
Diteteskan 5 mikroliter hasil isolasi DNA/PCR pada parafilm dengan
resuspensi terlebih dahulu
Diambil 1 mikroliter loading dye dan diteteskan di atas sampel isolasi DNA
(Sampel PCR tidak diberikan loading dye)
Diresuspensi menggunakan mikropipet
Diambil 2 mikroliter diamond, teteskan di atas loading dye
Diresuspensi/campur menggunakan mikropipet
Diganti ukuran mikropipet menjadi 7 μL
Diresuspensi menggunakan mikropipet
Diambil semua campuran
Dimasukkan ke dalam sumur dengan kondisi tegak lurus & lubang terlihat
jelas
Alat Elektroforesis
Dihubungkan alat elektroforesis dengan sumber arus dan dinyalakan sumber
arus pada tegangan 100 V, 26 menit hingga loading dye mencapai daerah
sekitar 1/3 ujung gel
Dimatikan sumber arus
Hasil Elektroforesis
2.3 Perhitungan
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.2 Pembahasan
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,
ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Harahap, 2018). Elektroforesis
merupakan teknik untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan atas ukuran (berat
molekul) dan struktur fisik molekulnya (Nugraha, et al., 2014). Elektroforesis
digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik
DNA, RNA dan protein. Elektroforesis terutama digunakan untuk mengamati hasil
dari DNA (deoxyribonucleic acid) yang diamplifikasi (Artati & Lubis, 2017).
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai hal, antara lain membandingkan
gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens berbagai
genom,DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab
kelainan genetik atau penyakit tertentu,mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam
sel atau jaringan tertentu,mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai
tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu,
mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi
natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen
DNA,RNA,protein dan aktivitas enzimatik,menganalisa fragmen DNA yang
diamplifikasi melalui PCR,mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar
individu,dan menentukan jumlah fragmen DNA yang dikloning dalam rekombinan
plasmid DNA (Kusnadi & Arumingtyas, 2020).
Prinsip teknik elektroforesis adalah berdasarkan migrasi partikel bermuatan di
bawah pengaruh medan elektronik pada kondisi yang konstan. Oleh karena setiap
nukleotida dalam molekul DNA memiliki muatan negatif, maka panjang suatu
molekul DNA dapat ditetapkan dengan teliti menggunakan teknik elektroforesis
yang memisahkan molekul berdasarkan berat molekul. Panjang suatu molekul DNA
yang sedang diteliti dapat diketahui dengan cara membandingkannya dengan standar
berat molekul DNA tertentu. Metode pemisahan DNA dengan elektroforesi ini secara
luas digunakan untuk tujuan analitik dan preparatif. Untuk analisis pemisahan
molekul DNA dengan ukuran kurang dari 500 nukleotida umumnya dilakukan
dengan menggunakan gel poliakrilamid, karena pori-pori gel poliakrilamid lebih
kecil dari molekul DNA yang melewatinya. Sedangkan pori-pori yang lebih besar
dimiliki oleh gel agarose yang dapat digunakan untuk analisis molekul DNA yang
lebih besar (Puspitaningrum, et al., 2018).
Pada praktikum ini elektroforesis dilakukan menggunakan Agarose gel
elektroforesis yang merupakan alat identifikasi fragmen asam nukleat seperti DNA
(Deoxyribonucleic acid) yang mengaplikasikan proses elektroforesis dalam cara
kerjanya. Alat elektroforesis akan menghasilkan medan listrik dengan cara
memberikan energi listrik pada elektroda dari sumber energi baik arus listrik searah
ataupun arus listrik bolak-balik. Dalam proses elektroforesis arus listrik dialirkan ke
dalam larutan buffer yaitu Tris-asetate (TAE). Muatan listrik yang berada pada
larutan TAE akan membawa fragmen-fragmen DNA bergerak melalui matriks-
matriks pada gel agarose, dimana DNA dengan fragmen pendek akan bermigrasi
lebih jauh dibanding fragmen DNA yang lebih panjang. Dengan begitu fragmen
DNA akan» terpisah “dari 'molekul lain yang tereanipur bersamanya. metode
elektroforesis melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak
berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Rubiyanto,
2016). Proses elektroforesis diawali dengan pengenceran TAE buffer 5x menjadi 1x
dengan mencampurkan 10 mL TAE 50x + 490 mL deion steril. Setelah itu proses
pembuatan gel agarose dengan mencampurkan 0.7 gram agarosa pada 35 mL buffer
TAE 1x dalam Erlenmeyer, lalu dipanaskan hingga agarose larut sempurna yang
ditandai dengan berubah menjadi warna bening menggunakan microwave. Setelah
larut, dimasukan kedalam sumur elektroforesis dan ditunggu hingga dingin - beku.
Pada alat elektroforesis dituangkan larutan agarose, dipasangi cetakan sumur, dan
ditunggu hingga mengeras. Selanjutnya adalah proses running elektroforesis.
Pertama dilepaskan cetakkan sumur secara perlahan, diletakkan gel beserta cetakan
pada tangka elektroforesis. Dituang TAE buffer 1x 400 mL hingga seluruh
permukaan gel terendam. Setelah terendam, disiapkan parafilm bening bersih sebagai
awal dari tahap persiapan sampel. Diambil sampel DNA atau PCR menggunakan
pipet dan diteteskan pada parafilm sebanyak 5 mikroliter dilakukan resuspensi.
Setelah itu, untuk sampel DNA ditambahkan loading dye 1 mikroloter agar
memberikan warna pada sampel dan diamond 2 mikloliter, resuspensi dilakukan pada
setiap tahapnya. Sedangkan untuk sampel PCR tidak perlu ditambahkan loading dye
karena sampel PCR sudah berwarna. Setelah itu diambil semua campuran dan
dimasukan kedalam sumur. Proses pemasukan ke dalam sumur dilakukan secara
tegak lurus. Proses running alat elektroforesis dilakukan dengan dihubungkan alat
elektroforesis dengan sumber arus, dan dinyalakan sumber arus pada tegangan 100
V selama 26 menit hingga loading dye tampak mencapai daerah sekitar 1/3 dari ujung
sel. Hasil elektroforesis kemudian divisualisasikan dengan sinar UV dan difoto
dengan kamera digital (Barker & Tett, 2005).
Pada proses elektroforesis sampel isolasi DNA dan PCR padi (Oryza sativa)
terdapat alat yang digunakan seperti elektroforator, UV transuliminator, alat pencetak
sumur, mikropipet, spindown, DNA ladder ikb, dan tabung erlenmeyer.
Elektroforator berfungsi untuk memberikan arus listrik agar proses elektroforator
dapat bekerja. UV Transuliminator berfungsi untuk memvisualisasikan ukuran dan
bentuk DNA yang telah dielektroforesis. Alat pencetak sumur digunakan untuk
membuat sumur-sumur pada sisi atasdari gel agarosa, yaitu tempat memasukkan
DNA ke dalam gel. Mikropipet berfungsi untuk memindahkan larutan reagen sesuai
volume yang diinginkan dan tip digunakan untuk mengambil larutan. Spindown
berfungsi untuk memisahkan bahan hingga homogen berdasarkan urutan massa
jenisnya. DNA ladder 1kb berfungsi sebagai pemanda berat molekul yang
mengandung delapan fragmen DNA beruntai ganda. Erlenmeyer digunakan pada
tahap pembuatan agarose, yang berfungsi sebagai tempat untuk mencampurkan
bahan-bahan (Puspitaningrum, et al., 2018). Bahan yang digunakan adalah sampel
template DNA yang telah diamplifikasi dan dilakukan system PCR, yang akan
ditentukan kualitas ukuran dan benyuk partikelnya. TAE Buffer 1 x yang berfungsi
untuk meneruskan arus listrik sehingga diterima oleh fragmen DNA yang berada
pada gel agarosa yang terendam pada larutan. Selain itu, berfungsi untuk menjaga
pH larutan pada saat migrasi fragmen berlangsung agar dalam keadaan setimbang.
Gel agarosa digunakan untuk mendeteksi kompleks-kompleks antigen-antibodi, dan
untuk analisis molekul DNA, RNA dan molekul protein. Gel agarose atau media
pemisah berfungsi sebagai pembawa gen pada makhluk hidup dan merupakan
matriks penyaring molekul, dengan laju pemisahannya lebih cepat membentuk
fragmen fragmen dan tidak bersifat toksik (Rubiyanto, 2016). Parafilm berfungsi
sebagai tempat pencampuran sampel dan reagen yang digunakan. Diamond nucleic
dye digunakan sebagai pewarna DNA dan dapat berpendar dalam gelap jika
diuraikan menggunakan paparan sinar UV. Loading dye digunakan sebagai penanda
pergerakan DNA dalam gel agarose, Loading berfungsi sebagai pewarna untuk
memantau migrasi molekul DNA pada gel dan sebagai pemberat agar molekul DNA
tidak keluar dari sumur. (Chilmi et al., 2020).
Beberapa faktor yang sangat mempengaruhi keberhasilan proses elektroforesis
diantaranya adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi gel agarose, konformasi DNA,
voltase, keberadaan pewarna DNA dan komposisi buffer elektroforesis (Fahlevi,
2017). Konsentrasi gel agarose yang digunakan untuk elektroforesis pada umumnya
berada pada rentang 0,2% - 3%, semakin rendah konsentrasi gel agarose maka
semakin cepat migrasi fragmen DNA. Besarnya tegangan medan listrik berpengaruh
terhadap terhdap mobilitas, semakin tinggi voltasenya maka semakin cepat terjadi
mobilitas. Keberadaan pewarna DNA berpengaruh terhadap visualisasi ukuran dan
kualitas DNA. Selain itu, adanya pewarna Etidium Bromida di dalam gel juga dapat
menyebabkan pengurangan kecepatan laju migrasi. Komposisi larutan buffer yang
memiliki ion tinggi akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik dan laju migrasi
molekul pun meningkat dan elektroforesis dapat berjalan dengan baik. Larutan buffer
berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium pemisah, dan berfungsi
sebagai media penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik. Larutan
buffer harus memiliki interkasi dengan molekul yang dipisahkan, dan pH yang
digunakan menjadi perhatian sehingga kumpulan molekul dapat dipisahkan satu
sama lain tetapi tidak mengalami perubahan struktur. Selain itu, sampel DNA dan
PCR yang digunakan juga berpengaruh terhadap hasil elektroforesis. Sampel yang
akan dipisahkan sangat memungkinkan memberi pengaruh laju perpindahan ditinjau
dari muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Jumlah muatan total akan berbanding lurus
dengan laju perpindahan, konsentrasi muatan yang bermigrasi tergantung pada pH.
Untuk ukuran molekul apabila yang diperoleh lebih besar menyebabkan perpindahan
molekul menurun dan membutuhkan energi perpindahan yang cukup besar
dibandingkan dengan bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama
(Harahap, 2018).
Menurut Widodo (2003) pemuliaan tanaman diartikan sebagai ilmu dan seni yang
mempelajari adanya pertukaran dan perbaikan karakter tanaman yang diwariskan
pada suatu populasi baru dengan sifat genetik yang baru. Seiring perkembangan
zaman dan kemajuan teknologi pemuliaan tanaman mulai beranjak dari konvensional
ke arah bioteknologi. Dengan bantuan teknik molekuler, pemuliaan tanaman menjadi
lebih efisien dalam hal waktu dan lebih akurat dalam menentukan individu terpilih
hasil persilangan. Teknik molekuler dapat mengatasi kendala yang terkesan sulit
untuk menyeleksi sifat-sifat jenis unggul dalam populasi, karena kerumitan sifat
genetik yang berinteraksi dengan faktor lingkungan (Taryono, 2016). Elektroforesis
merupakan salah satu teknik molekuler yang digunakan dalam pemuliaan tanaman.
Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Pada teknik
pemuliaan hasil tersebut dapat digunakan untuk mengetahui DNA tanaman dengan
karakteristik tertentu, membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom,DNA finger printing, mengetahui ada
atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu,mendeteksi
lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengidentifikasi
persamaan dan perbedaan genetik antar individu,dan menentukan jumlah fragmen
DNA yang dikloning dalam rekombinan plasmid DNA (Kusnadi & Arumingtyas,
2020).
Berdasarkan hasil elektroforesis yang telah dilakukan pada sampel 1 isolasi DNA
tanaman padi (Oryza sativa) kelompok 5 tidak terlihat dengan jelas sedangkan pada
sampel 2 terlihat pita DNA. Lalu, pada hasil elektroforesis sampel PCR tidak terlihat
adanya pita dari fragmen DNA. Pada sampel hasil elektroforesis yang tidak terlihat
pitanya dapat terjadi karena berbagai faktor. Faktor tersebut yaitu sampel daun yang
digunakan terlalu sedikit atau proses penghancuran melalui penggerusan kurang
sempurna. Kemungkinan lain juga dapat disebabkan karena sampel daun yang terlalu
banyak tetapi reagen yang digunakannya kurang sehingga DNA tidak dapat terisolasi
atau terisolasi hanya sedikit (Uslan & Pharmawati, 2015). Selain itu, pada sampel
dua terdapata smear. Smear mengindikasikan bahwa DNA genomik yang diisolasi
sudah tidak utuh lagi, kemungkinan terpotong-potong saat ekstraksi berlangsung
sehingga DNA yang digunakan belum murni, masih tercampur dengan protein dan
polisakarida lainnya. Dapat disebakan pula karena masih adanya larutan yang
terbawa dari hasil isolasi DNA karena adanya sampel DNA yang tertinggal di sumur
gel pada saat elektroforesis menunjukkan tingginya kontaminan polisakarida yang
ikut terekstrak (Oevania et al., 2017).
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan didapati kesimpulan bahwa:
1. Hasil elektroforesis PCR dan isolasi DNA sel agarose menunjukkan daerah SOD
dan katalase pada amplikon DNA genom padi (Oryza sativa) ditandai dengan
pita yang terbentuk.
4.2 Saran
Dalam proses praktikum harus dilakukan secara aseptik agar sampel terhindar
dari zat-zat pengganggu. Selain itu, alat-alat yang akan digunakan sebaiknya
dilakukan autoklaf terlebih dahulu agar tidak terjadi kontaminasi pada sampel. Pada
saat resuspensi pastikan tidak ada udara yang masuk ke dalam sampel. Selain itu,
karena elektroforesis menggunakan sampel hasil isolasi DNA dari praktikum
sebelumnya, diharapkan dalam tahap isolasi DNA dilakukan dengan baik, agar hasil
isolasi DNA murni dan pada tahap elektroforesis tidak dihasilkan smear.
DAFTAR PUSTAKA
Artati, D., & Lubis, D. S. (2017). Optimasi performa dna marker pada elektroforesis gel.
Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur, 15(2), 47-50.
Barker, K., & Tett, S. (2005). At the bench: a laboratory navigator . Cold Spring Harbor
Laboratory Press.
Chilmi, L., Rachmawati, Y., Susilowati, T., Rokhim, S., & Tyautari, I. (2020). Sus sp.
uji deteksi gen DNA enconding cyt b pada smapel soft gel candy menggunakna
metode PCR. Journal of Halal Product and Research, 1(1), 14-20.
Fahlevi, M. R., Bakti, D., Sitepu, S. F., & Prasetyo, A. E. (2018). Karakterisasi
Molekuler Elaeidobius kamerunicus Faust.(Coleoptera: Curculionidae) Asal
Sumatera Utara Menggunakan Metode Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP): Insect Molecular characterization of Elaeidobius
kamerunicus Faust.(Coleoptera; Curculionidae) From North Sumatra Using
Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Jurnal Online
Agroekoteknologi, 6(2), 259-270.
Harahap, M. R. (2018). Elektroforesis: Analisis elektronika terhadap biokimia
genetika. CIRCUIT: Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro, 2(1), 21-26.
Kusnadi, J., & Arumingtyas, E. L. (2020). Polymerase Chain Reaction (PCR): Teknik
dan Fungsi. Universitas Brawijaya Press.
Nugraha, F., Roslim, D. I., & Ardilla, Y. P. (2014). Analisis Sebagian Sekuen Gen
Ferritin2 pada Padi (Oryza sativa L.) Indragiri Hilir, Riau. Biosaintifika: Journal
of Biology & Biology Education, 6(2), 70-79.
Oevania, N., Roslim, D, I., & Herman. (2017). Teknik isolasi dan elektroforesis DNA
total pada tanaman ubi kayu genotype roti dan menggalo. Repository FMIPA,
1(1), 1-6.
Puspitaningrum, R., & Adhiyanto, C. (2018). Genetika Molekuler Dan Aplikasinya.
Deepublish.
Rubiyanto, D. (2016). Teknik dasar kromatografi. Deepublish.
Sobir, C. S., Mattjik, A. A., Wahyudi, A. T., Meryandini, A., Bintang, M., Suhartono,
M. T., ... & Syamsu, K. (2021). Keterlibatan Biosains dalam Peningkatan
Produksi Hasil Pertanian Berkualitas dan Ramah Lingkungan. PT Penerbit IPB
Press.
Taryono (2016). Pengantar Bioteknologi Untuk Pemuliaan Tanaman. UGM PRESS.
Uslan., & Pharmawati, M. (2015). Optimasi konsentrasi DNA dan MgCl2 pada Reaksi
Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA untuk
analisis keragaman genetik Tanaman Faloak (Sterculia quadrifida R.Br).
Jurnal Bios Logos, 5(1), 26-34.
LAMPIRAN
Tabel 4. Dokumentasi Proses Elektroforesis
Proses Elektroforesis
Gambar 9. Sampel isolasi DNA didalam Gambar 10. Hasil elektroforesis sampel
sumur elektroforesis isolasi DNA genom padi (Oryza sativa)
(Sumber: Dokumentasi Kelompok 5 2022) kelompok lain
(Sumber: Dokumentasi Kelompok 5 2022)
Gambar 11. Sampel PCR didalam sumur Gambar 12. Hasil elektroforesis sampel
elektroforesis PCR genom padi (Oryza sativa)
(Sumber: Dokumentasi Kelompok 5 2022) (Sumber: Dokumentasi Kelompok 5 2022)