LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

ELEKTROFORESIS

Dosen Pengampu : Dr. Yustinus Ulung Anggraito, M.Si

Dr. Noor Aini Habibah, S.Si., M.Si.

Oleh:

Nurtantuhu nastiti 4401416045

Salwa Nurafifah 4401416004

Nor Laelatul Hidayah 4401416031

Fajrin Nabila 4401416037

Kelompok 6

15 April 2019

PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2019
A. Tujuan
1. Memvisualisasi DNA hasil isolasi pada elektroforesis gel agarose 1%

B. Landasan teori

Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan

memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat
berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis gel adalah teknik memisahkan
suatu makromolekul dengan cara memberi gaya pada makromolekul tersebut
untuk melewati medium berisi gel dibantu dengan tenaga listrik.
Menurut (Harahap,2018) Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen
utama dalam penggunaanya. Yang pertama adalah larutan elektrolit yang
berfungsi sebagai pembawa komponen. Umumnya berupa larutan buffer
dengan pH tertentu sesuai dengan karakteristik senyawa yang akan dipisahkan.
Berikutnya media pemisah merupakan tempat proses pemisahan terjadi. Media
pemisah ini berupa kertas (selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji, gel
polikrilamid, busa poliuretan atau agar-agar. Selanjutnya yang paling penting
adalah elektroda yang berfungsi sebagai penghubung arus listrik dengan media
pemisah dan baterai atau arus listrik sebagai sumber energi (source) pada
rangkaian alat
Keberhasilan dari teknik elektroforesis dipengaruhi pemilihan medium
pemisahnya. Ada dua medium yang sering digunakan dalam menggunakan
elektroforesis. Yang pertama gel Agarosa. Merupakan metode standar untuk
mengidentifikasi serta memurnikan fragmen-fragmen Deoxyribo Nucleic Acid
(DNA) dan Ribose Nucleic Acid. Senyawaan tersebut merupakan pembawa
genetika pada makhluk hidup-dilakukan pada medan listrik horizontal.
Kelebihan dari gel ini lebih mudah, sederhana dan laju pemisahannya lebih
cepat membentuk fragmenfragmen dan tidak bersifat toksik. Hanya saja
kelemahannya gel ini memiliki sensitifitas tinggi dan mudah rusak sehingga
memerlukan ketelitian dan kehati-hatian pada proses pengerjaannya. Yang
kedua gel poliakrilamida. Gel ini memiliki memiliki resolusi tinggi pada hasil
pemisahannya. Membutuhkan tegangan listrik yang tinggi pada pengerjaannya
dan dilakukan pada medan listrik vertical. Persiapan pengerjaan membutuhkan
waktu relatif lama, mahal dan memiliki laju pemisahan yang lebih lambat
dibandingkan gel Agarosa (Harahap, 2018).
 Gambar. Rangkaian Alat Elektroforesis (Harahap, 2018)

Sifat agarosa yang tidak bermuatan, membuat agarosa banyak

diaplikasikan dalam bidang bioteknologi, baik sebagai media kultur ataupun
media elektroforesis. Dalam elektroforesis, agarosa digunakan untuk
mendeteksi kompleks-kompleks antigen-antibodi, dan untuk analisis molekul
DNA, RNA dan molekul protein (Aslinda dan Ahmad, 2016). Menurut
(Fatciyah, 2011) konsentrasi agarose yang digunakan akan menentukan
besarnya pori-pori gel yang akan memisah-misahkan DNA. Semakin rendah
konsentrasi agarose maka matriks gel akan semakin kecil dan fragmen DNA
dapat dipisah semakin jauh berdasarkan ukurannya.
Agarose gel electrophoresis digunakan untuk memperkirakan konsentrasi
DNA plasmid dan memungkinkan verifikasi apakah sampel terkontaminasi
dengan DNA kromosom atau dengan DNA, memisahkan molekul dalam
dimensi, bentuk, dan kehebatan total muatan melalui migrasi molekul-molekul
ke medan listrik (Barros, 2018). Menurut (Ningsih, 2017) bahwa elektroforesis
dan visualisasi dilakukan dengan gel agarosa, visualisai DNA dilakukan
dengan cara merendam gel agarosa hasil elektroforesis dalam campuran EtBr
dan TAE selama 1 jam kemudian diletakkan gel diatas UV Transiluminator.
Dalam hal ini pemberian buffer TAE perlu diperhatikan karena menurut
(Pandey, 2015) DNA dengan viskosistas tinggi tidak dapat dilarutkan dalam
buffer TAE dan tidak cocok untuk elektroforesis karena terperangkap ke dalam
sumur selama pemisahan elektroforesis.
Laju dalam elektroforesis sangat bergantung pada kekentalan medium (n),
ukuran atau bentuk (r), dan muatan molekul (q). Kekuatan asam pada medium
juga mempengaruhi besar muatan pada saat ionisasi berlangsung sehingga
diperlukan larutan buffer untuk mengatasi masalah ini. Dan juga perlu
dilakukan analisis terhadap kemampuan media untuk memisahkan
molekulmolekul agar lebih efektif dan maksimal. (Harahap, 2018).
C. Alat dan bahan
 Alat

Nama alat Fungsi

Erlenmeyer Mencampur larutan atau sebagai
wadah larutan
Microwave Melarutkan agarose dengan suhu
tinggi
Mesin Elektroforesis (chamber, sisir Membuat gel yang terdapat protein
dan power supply) atau materi genetic (DNA)
Gel doc (UV transiluminator) Memvisualisasi gel dengan
menggunakan sinar UV
 Bahan

Nama alat Fungsi

Agarose Sebagai gel elektroforesis untuk
memisahkan DNA yang berukuran
besar sekitar (0,1-20 kb)
Tric acetic acid EDTA (TAE) 1x Termasuk electrophoresis buffer yang
digunakan sebagai larutan penyangga
dalam gel agarose elektroforesis
Ethidium promide (10 mg/ml) Visualisasi DNA pada gel
elektroforesis
Loading dye Sebagai pemberat agar DNA tidak
menghilang dari sumur

D. Metode

Kemudian dipanaskan Larutan didinginkan pada

Sebanyak 0,5 g agarose
dalam microwave sampai suhu kamar sampai dingin
dilarutkan dengan 50 ml
larutan menjadi jernih (hangat-hangat kuku)
Tris acetic acid EDTA (TAE)
1x

Setelah membeku, gel Agarose kemudian dituang Sebanyak 1 µl Ethidium

dimasukkan bak pada cetakan gel yang bromide (10 mg/ml)
Sebanyak 5 µl larutan
elektroforesis DNA
yang telah telah dipasang sisir, dan dimasukkan larutan
dicampur
diidi denganTAE
larutan buffer 2 µl1x dibiarkan sampai agarose dan dicampur
loading
sampaidye kemudian
semua gel membeku sampai homogen DNA
Keberadaan
Hasil positifpita-pita
ditunjukkan
dimasukkan
terendam ke dalam Running dilakukan pada produk PCR diamati di atas
adanya pita berwarna
sumur-sumur pada gel 135 volt selama 20 menit UV transiluminator
jingga pada gel agarose
 Skema Pipetting pada Parafilm

Loading dye diambil Loading dye diletakkan

sebanyak 3 uL di atas plastik parafilm
menggunakan dan di bagi menjadi 10
mikropipet titik

DNA Sampel dicampur DNA Sampel di ambil

dengan Loading dye dengan mikropipet
diatas kertas parafilm sebanyak 3uL

Memasukkan DNA
Campuran Loading dye Ladder pada sumur
dan Sampel di masukkan pertama di sebelah kiri,
ke dalam sumur sumur selanjutnya untuk
sampel

Semua isi Sampel dalam

Sampel di Running pada mikropipet dimasukkan
120 Volt selama 30 ke dalam sumur lalu
Menit mikropipet diangkat dan
dilepaskan
 E. Hasil Pengamatan

No Proses Keterangan
1. Memanaskan larutan agarose 1. Melarutkan agarose dalam TAE di
dan TAE microwave sampai mendidih dan
nampak jernih

2. 1. Memasang sisir untuk membuat

sumur
2. Menuangkan larutan ke dalam
cetakan gel
3. Sampel dispindown 1. Sampel dispindown memastikan
DNA terkumpul di bagian dasar
mikrotube
2. Durasi waktu spindown cukup
sebentar saja

4. Menuangkan buffer TAE 1. Menuangkan buffer TAE sebanyak

750 µl ke dalam buffer tank
2. Memasukkan gel beku ke buffer tank
yang sebelumnya diisi buffer TAE
hingga terendam
3. Ketika pemasangan buffer tank
digoyang supaya tidak ada
gelembung yang terbentuk di bagian
dasar

5. Pipetting sampel DNA dan 1. Meneteskan loading-dye diatas kertas

loading dye paraffin
2. Mencampur 3 mikrolit dna diambil
 dicampur lading dye yg ada diatas
kertas parafine menggunakan
mikropipet
3. Perbandingan volume loading dye:
sampel= 1: 3
4. Sumur pertama diisi dengan DNA
ladder

6. Memasukkan campuran 1. Fungsi loading dye sebagai pemberat

loading dye dan sampel ke supaya DNA tidak menghilang dari
dalam sumur sumur
2. Campuran loading dye dan sampel
dimasukkan ke tengah-tengah sumur

7. Voltase gel padat 1. Gel agarose divoltase menggunakan

120 volt
2. Voltase dilakukan selama 30 menit
3. Kabel hitam menunjukkan kutub
negative
4. Kabel merah menunjukkan kutub
positif
5. Bagian kutub negative akan
menghasilkan lebih banyak
gelembung dibandingkan kutub
positif
6. Terjadi pemisahan antara loading dye
dan DNA
7. DNA akan bergerak dari kutub
negative ke kutub positif
8. Loading dye berwarna ungu sebagai
penanda supaya pita DNA tidak
 melewati batas
8. Staining gel padat 1. Memasukkan gel padat ke dalam
pewarna ETBr
2. Waktu yang dibutuhkan untuk
mewarnai gel yaitu 3-5 menit
3. ETBr bersifat karsinogenik sehingga
perlu menggunakan sarung tangan
lateks dan menggunakan alat untuk
mencelupkan gel padat

9. Pemindahan gel padat yang 1. Gel padat yang tercelup ETBr

telah diwarnai diangkat kemudian ditiriskan
2. Gel padat dimasukkan ke dalam
buffer TAE

10. Pemindahan ke trans UV 1. Gel padat yang telah dimasukkan

dalam buffer TAE kemudian
diangkat, ditiriskan dan dimasukkan
ke UV transluminator
2. Meletakkan gel padat tepat di tengah
supaya termati oleh kamera yang
terdapat dalam UV transluminator
3. Aplikasi yang digunakan yaitu
 alfaview
4. DNA lader yang digunakan
berukuran 50 basepairs

11. Urutan hasil visualisasi DNA hewan dan

mikroba
 DNA ledder
 1: DNA hati
 2: DNA jantung
 3: DNA paru-paru
 4: DNA usus
 5: DNA bakteri E. coli
 6: DNA bakteri E. coli
 7: DNA bakteri E. coli
 8: DNA bakteri E. coli

12. Hasil visualisasi DNA Urutan hasil visualisasi DNA tumbuhan

menggunakan UV  DNA ledder
transluminator  1 dan 2: DNA daun pisang
 3 dan 4: DNA daun durian
 5, 6 dan 7: DNA daun pepaya
 8: DNA daun singkong
 9: DNA daun pisang
 10: DNA daun durian
 11: DNA daun papaya
 12: DNA daun singkong
 13: DNA daun papaya
 14: DNA daun pisang
  15: DNA daun durian
 16: DNA daun singkong

F. Pembahasan

Metode standar yang digunakan untuk memisahkan,

mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel
agarosa. Agarosa merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan
polimer netral dan sedikit mengandung sulfat. Elektroforesis gel agarosa
adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan,
ukuran dan bentuk. Gel agarose sendiri berfungsi untuk memisahkan
molekul yang berukuran lebih dari 100bp (sebagai penyaring). Konsentrasi
agarose mempengaruhi hasil elektroforesis, karena semakin tinggi
konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarose lebih kecil
sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya.
Berdasarkan hasil pengamatan dengan menggunakan
elektroforesis, secara umum isolasi DNA plasmid dengan elektroforesis
berhasil, dilihat dari pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis
[ CITATION Mol04 \l 1033 ]. Pita tersebut terlihat di bawah sinar ultra
violet melalui pewarnaan dengan etidium bromida. Etidium bromida
umum digunakan untuk visualisasi DNA pada gel elektroforesis. Etidium
bromide dapat menyisip di antara basa-basa DNA. [ CITATION Eka08 \l
1033 ]. Jumlah pita dan keberadaan smear juga dilihat untuk menentukan
keberhasilan isolasi plasmid DNA. Jika pita yang muncul banyak dan
terlihat adanya smear, hasil pengamatan dianggap masih mengandung
kontaminan seperti protein, fenol dan RNA [ CITATION WCl01 \l 1033 ].
Kemurnian hasil isolasi yang rendah dapat disebabkan karena
proses purifikasi yang kurang baik sehingga mempengaruhi hasil
pengukuran dengan spektrofotometri. Jenis zat pengotor dapat dilihat dari
hasil visualisasi isolasi plasmid. Kontaminan yang berupa RNA yang
terdegradasi dalam sampel ditandai dengan keberadaan pita terang di
bawah gel elektroforesis. Kontaminasi protein tidak dapat divisualisasi
melalui elektroforesis karena protein tidak dapat terwarnai oleh etidium
bromida [ CITATION Eka08 \l 1033 ].

Gambar DNA ladder 1 kb Fermentasi (thermosciencetificbio, 2012)

Untuk menentukan keberhasilan PCR, dilakukan elektroforesis.

Pada proses elektroforesis kali ini, digunakan ladder 1 kb. Seperti yang
terlihat pada gambar diatas, merupakan gambar DNA ladder yangbiasa
digunakan dalam proses elektroforesis. Berdasarkan hasil yang didapat
yaitu hasil elektro foresis nomor 8, dilihat bahwa tidak ada band DNA
yang terlihat pada hasil PCR kelompok 6. Kegagalan tidak terlihatnya
band ini bisa disebabkan karena kesalahan pada proses elektroforesis atau
pada proses PCR. Proses PCR ini bisa disebabkan oleh beberapa faktor,
yaitu suhu, waktu, dan konsentrasi. Sedangkan untuk preparat usus yang
ditunjukkan pada urutan nomor 5 juga terjadi kegagalan sehingga tidak
terlihat band DNA dan hanya terlihat pendaran cahaya yang merupakan
hasil kontaminan dari proses amlifikasi atau proses pemurnian DNA. Hal
ini dikarenakan isi dalam usus kurang bersih dalam proses pencuciannya
sehingga mengganggu hasil dari proses elektroforesis. Hasil restriksi
plasmid untuk kelompok 6 (nomor 5 dan 8) juga tidak dapat dilihat pada
 bagian atas. Apabila proses restriksi berhasil, akan dilihat 2 band yang
berbeda. Seperti yang telah dijelaskan di pembahasan diatas, kegagalan
terlihatnya band ini bisa disebabkan karena kesalahan pada proses
amplifikasi DNA, elektroforesis atau pada proses PCR.
DNA tumbuhan yang diisolasi oleh kelompok 6 adalah 2 sampel
pepaya, dimana sampel pertama gagal dibentuk pita DNA yang sempurna
karena adanya kontaminan, ditandai dengan hasil elektroforesis yang
seluruhnya berwarna putih. Sedangkan sampel kedua dapat dikatakan
berhasil karena hasil elektroforesisnya bersih dan pita DNA dapat
divisualisasikan.
Langkah-langkah elektroforesis DNA salah satunya menggunakan
loading dye yang berfungsi memperberat DNA hasil isolasi sehingga
DNA tidak hanyut pada agar dan DNA tetap berada di dalam sumur agar.
Dalam peletakan loading dye yang ditambah dengan DNA, dilakukan
dengan sangat hati-hati sebab sumur agar yang terbentuk sangat kecil dan
agar yang cenderung rentan sangat memungkinkan untuk sampel meluber
dan agar menjadi bocor.
DNA berukuran sangat kecil dan sulit untuk diamati, oleh karena
itu untuk memudahkan pengamatan DNA diwarnai menggunakan Etidium
bromida. Pewarna yang digunakan tidak sembarang pewarna. Etidium
bromida ini akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan baru
akan tampak jika di bawah lampu UV, warnanya ’orange fluoresence’.
Etidium bromida mempermudah pengamatan DNA dalam gel. Hanya saja
etidium bromida bersifat karsinogenik sehingga pewarnaannya harus
dilakukan dengan sangat hati-hati dan tetap menggunakan sarung tangan
lateks.
Adanya kesalahan visualisasi DNA antara lain karena adanya
kontaminan yang ikut direaksikan saat isolasi berlangsung, entah dari
tanaman yang diisolasi atau dari kontaminan tangan praktikan. untuk
mencegah hal tersebut terjadi maka wajib hukumnya sampel yang akan
diisolasi dan tangan praktikan disemprot alkohol untuk mematikan
kontaminan yang ada.

G. Kesimpulan dan saran

 Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, dapat disimpulkan
bahwa:
1. Hasil elektroforesis nomor 8, dilihat bahwa tidak ada band DNA yang
terlihat pada hasil PCR kelompok 6.
2. Hasil elektroforesis nomor 5 juga terjadi kegagalan sehingga tidak terlihat
band DNA dan hanya terlihat pendaran cahaya yang merupakan hasil
kontaminan dari proses amlifikasi atau proses pemurnian DNA.
3. Pada isolasi DNA tumbuhan sampel pertama gagal dibentuk pita DNA
yang sempurna karena adanya kontaminan, ditandai dengan hasil
elektroforesis yang seluruhnya berwarna putih. Sedangkan sampel
kedua dapat dikatakan berhasil karena hasil elektroforesisnya bersih
dan pita DNA dapat divisualisasikan.
4. Kegagalan tidak terlihatnya band ini bisa disebabkan karena kesalahan pada
proses amplifikasi DNA, kontaminasi, elektroforesis atau pada proses PCR.
Saran:
1. Diharapkan kedepannya praktikan dalam melakukan kegiatan
praktikum lebih berhati-hati lagi dan teliti agar dapat menimalisir
kemungkinan kegagalan dalam pengamatan hasil praktikum.

H. Daftar pustka
Aslinda, Wery., Ahyar., Ahmad. 2016. Isolasi dan Karakterikasi Agarosa
dari Makroalga Merah Euchema Cottoni untuk Pemisahaan
Fragmen DNA. Journal of Natural Science. Vol 5(3) :307-317.
ISSN-p: 2338-0950.
Barros, H. L., Moresco, G., Stefani, V. A. 2018. Simple Protocol for the
Isolation, Quantification and Quality Assessment of DNA and
RNA. Rev.. Journal of Biochemical and Biophysical Methods .
Virtual Quim. Vol 10, No. 5. ISSN 1119-1126.

Clark, W., 2001. An Introduction to DNA: Spectrophotometry, Degradation, and

the 'Frankengel' Experiment. Diakses dari
www.ableweb.org/volumes/vol-22/5-clark.pdf pada tanggal 18 April
2019

Fatchiyah.2011. Isolasi DNA & RNA.Table of Genetic Disorders. Jurusan

Biologi. Universitas Brawijaya.
 Harahap, Ridwan., M. 2018. Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap
Biokimia Genetika. Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro,
Vol.2, No.1. ISSN: 2549-3698.

Molloy, M.J. et al., 2004. Effective and Robust Plasmid Topology Analysis
and the Subsequent Characterization of the Plasmid Isoforms
thereby Observed. Nucleic Acids Research, 32(16), Hal. 1-10.
Ningsih, Utami., H. Prakarsa, Putra. dan Margawati , Tri. 2017. Koleksi
DNA dan Konfirmasi Marka ETH10 Pengkode Sifat Pertumbuhan
pada Sapi Pasundan . BIOTROPIC The Journal of Tropical
Biology. Vol 1. No 1.
Pandey, A., Tamta, S. 2015. High-molecular-weight DNA extraction from
six Quercus species of Kumaun Himalaya, India. International
Journal of Advanced Research . Volume 3, Issue 7, 30-34. ISSN
2320-5407.

Pratiwi, E.B., 2008. Sintesis dan Pengklonan Fragmen Gen tat

(Transaktivator) HIV-1 ke dalam Vektor Ekspresi Prokariot pQE-
80L. Depok: Universitas Indonesia Universitas Indonesia.

I. Lampiran
 Urutan hasil visualisasi DNA

Hewan dan mikroba

Pengamatan hasil visualisasi

DNA

Urutan hasil visualisasi DNA

Tumbuhan