1

PENDAHULUAN
Latar Belakang

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan

purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarose. Migrasi

elektroforesis DNA melalui gel agarose, arus listrik, dan suhu. Molekul DNA

yang bermuatan negative saat elektroforesis pada gel agarose berbanding terbalik

dengan konsentrasi gelnya. Migrasi struktur molekul yang besar akan lebih lambat

dibandingkan struktur molekul yang melewati pori-pori gel (Hapsari, 2012).

Uji kuantitatif DNA adalah analisi untuk menentukan kandungan atau

jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya

telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara

uji kualitatif. DNA yang berkualitas tinggi yang terdapat dalam suatu ekstraksi

yang merupakan kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler

terutama dalam penandaan sidik jari DNA (Larasati, 2011).

Uji kualitas dan kuantitas perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas dan

kuantitas DNA yang telah di isolasi yang meliputi konsentrasi dan tingkat

kemurniaan DNA genom. Analisis ini dapat dilakukan dengan menggunakan alat

spektrofotometer. Analisi kualitatif DNA genom dapat dilakukan dengan

elektroforesis pada gel agarose. Oleh karena itu perlu dilakukan percobaan

prkatikum isolasi DNA dan uji Kualitatif dan kuantitas DNA yang telah di isolasi

(Muhammad, 2012).

Teknik molekuler sangat bervariasi tergntung cara pelaksanaan untuk

mendapatkan data maupun tingkatan target data yang diinginkan sesuai

kemudahan pelaksanaan, kapabilitas sumber daya manusia, fasilitas dan peralatan

serta kecukupan finansial. Selain faktor faktor di atas, maka masalah biaya selalu
 2

menjadi faktor penghambat, karena harga bahan kimia yang sangat maha serta

pengadaannya memakan waktu yang sangat lama, karena bahan kimia yang

diperlukan merupakan bahan impor(Maulidia, 2017).

Larutan Etbr digunakan sebagai alat untuk mengidentifikasi dan mengukur

semi-kualitatif fragmen DNA yang terseperasi dalam gel. Selain itu larutan EtBr

akan terikat diantar dua untai ganda DNA dan berinterkasi diantara basa molekul

DNA, sehingga menyebabkan pita DNA dalam gel agarose akan berpendar kuning

jingga bila disinari ultraviolet padapanjang gelombang yang pendek karena

ewarna ini mengandung zat fluorescence (Windiastika, 2012).

Tujuan Praktikum

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui cara menguji

kualitas DNA pada stok DNA serta dapat memurnikan DNA dengan metode

elektroforesis dimana akan terlihat pita DNA.

Kegunaan Penulisan

Adapun kegunaan penulisan adalah sebagai salah satu syarat untuk dapat

mengikuti praktikum di laboratorium Genetika Molekuler Program Studi

Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara dan sebagai sumber

informasi bagi yang membutuhkan.

 3

TINJAUAN PUSTAKA

Kuantifikasi dan analisa kualitas DNA/RNA di perlukan untuk mengetahui

kemurnian dan jumlah konsentrasi DNA/RNA yang diisolasi. Kualitas DNA/RNA

terbaik menunjukan keadaan DNA/RNA bebas dari kontaminasi seperti

kontaminasi protein dan garam yang terdapat pada DNA/RNA yang diisolasi.

Kuantitas DNA/RNA menunjukkan konsentrasi DNA/RNA. Uji kualitas DNA

dapat dilakukan dengan cara elektroforesis. Elektroforesis adalah teknik

pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan tingkat migrasi dalam

sebuah medan listrik (Irawan, 2008).

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekuler. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini molekul molekul tersebut dipisahkan

berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel.

Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul yang bersangkutan.

Elektroforesis dilakukan untuk tujuan analis (Setiadi etal., 2014).

Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal elektroforesis, pengecekan

hasil isolasi DNA pada gel agarose. Pengukuran konsentrasi DNA dengan

spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein

diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung

melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa

dipakai dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0(Harahap,

2017).

Tingkat kemurnian DNA berkorelasi dengan kualitasnya. DNA dikatakan

berkualitas jika memilki tingkat kemurniaan yang tinggi, karena telah termurnikan
 4

dari kontaminan seperti RNA, protein, dan lipid. Tingkat kemurnian DNA diukur

dengan membandingkan absorbansi asam nukleat pada Panjang gelombang A260

nm dan protein A280 nm. Kontaminasi DNA dapat dilihat dengan semakin

meningkatnya nilai absorbansi protein (Albert et al., 2008).

Analisi kualitatif genom menggunakan elektroforesis pada gel agarose

merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan

furifikasi fragmen DNA. Pewarna ethidium bromide digunakan sebagai alat

identifikasi fragmen DNA yang terpisah di dalam gel. Ethidium bromide akan

terikat di antar dua untai ganda DNA sehingga pita DNA dalam gel agarose akan

berpencar karna pewarna ini mengandung zat fluresen. Ikatan DNA ethidium

bromide ini akan terekspos pada sinar UV tingkat medium, sekitar Panjang

gelombang 300 nm (Fatchiyah, 2011).

 5

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Adapun praktikum inidilaksanakan pada hari Senin tanggal 09Maret 2020

pada pukul 13.00 WIB sampai dengan selesai di Laboratorium Genetika

Molekuler Program Studi Agroteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sumatera

Utara, Medan.

Alat dan Bahan Praktikum

Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini adalah tips digunakan

untuk dipasangkan dengan micropipet, micropipet digunakan untuk memindahkan

dan mengambil cairan dan dalam jumlah kecil secara akurat, chamberwell untuk

sebagai alat elektroforesis dan menvisualisasikan genetik pada agar, sisir

chamberwell untuk membuat sumur pada agar, power supply digunakan sebagai

penyalur tegangan listrik ke berbagai komponen, magnetic stirrer dan hot plate

digunakan untuk menghomogenkan suatu larutan, geldoctransimulator untuk

mendokumentasikan hasil elektroforesis dan sebagai alat untuk visualisasi materi

genetic dengan sinar UV, Erlenmeyer digunakan untuk menampung larutan, botol

aquades digunakan untuk tempat atau wadah aquades.

Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah stok DNA

sebagai objek praktikum yang akan diamati, buffer TAE untuk mencegah struktur

DNA dan menghantar listrik yang baik saat elektroforesis, agarose sebagai bahan

pemadat, aquades sebagai bahan sterilisasi, loading dye sebagai pemberat saat uji

kualitas dan agar tidak keluar dari sumuran, larutan EtBr untuk mengikat DNA

dan sebagai pewarna.

 6

Prosedur Praktikum

- Disiapkan gel agarose konsentrasi 0.8 % (b/v)

- Ditimbang agarose sebanyak 1.2 gr kemudian dilarutkan kedalam 80 ml

buffer TAE 1x

- Dimasukan larutan kedalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan dan diaduk

dengan pengaduk magnetik hingga bening

- Ditambahkan larutan EtBr sebanyak 1µl

- Dihomogenkan dengan magnetik stirrer

- Dimasukan ke dalam setakan agar yang telah dipasang sisir pembuat

lubang dan dibiarkan memadat selama ±60 menit

- Dilakukan uji kualitas DNA dengan elerktoforesis metode standar dengan

memasukkan 2µl loading dye ditambah 3µl stok DNA dan dihomogenkan

- Dimasukkan campuran stok DNA yang telah disiapkan kedalam sumur

pada gel yang telah diberi buffer TAE sampai agar terendam

- Dielektroforesis setelah semua lubang sumur gel berisi

- Dilakukan running elektroforesis pada kondisi 70 volt, current 104

Ma,Power 14 W selama 60 menit

- Divisualisasi DNA yang telah dielektroforesis dengan menggunakan UV

transiluminator

- Di foto hasil praktikum

 7

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

NO GAMBAR KETERANGAN
.
1.

Ditimbang agar 1,2 gr

2.

Diambil buffer TAE 80 ml

3.

Dimasukkan buffer TAE dan agar yang

telah ditimbang kedalam gelas

erlenmeyer

4.
Dihomogenkan dengan menggunakan

magnetic stirer dan hotplate hingga

warnanya berubah menjadi bening

 8

5.

Diambil EtBr 1 µl lalu dimasukkan

kedalam gelas erlenmeyer lalu di spiil

6. Dituangkan agar kedalam chamberwell dan

ditunggu agar tersebut hingga padat ±1 jam

7. Dituang buffer TAE ke dalam chamber

well hingga agar tenggelam

8. Dituang loading dye 3 µl kewadah dan

dihomogenkan dengan stok DNA 2 µl

9. Dimasukkan kelubang well dengan

menggunakan mikropipet
 9

10. Dibuat di power supply ± 1 jamdengan 70

volt,current 104 Ma,Power 14W selama 60

menit

11. Dimasukkan kedalam gel doc

transluminator

12. Difoto hasil praktikum

Pembahasan
 10

Pembahasan

Uji kualitas DNA adalah suatu metode yang digunakan untuk melihat

konsentrasi dan kemurnian DNA dengan menggunakan spektrofotometer dan

elektroforesis gel. Hal ini sesuai dengan literatur Larasti (2011)yang menyatakan

bahwa DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan kualitas untuk

melihat konsentrasi dan kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer

dan elektroforesis gel. Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal

elektroforesis, pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose.

Pada praktikum ini, alat yang digunakan adalah Vortex digunakan untuk

menghomogenkan. Tips digunakan untuk dipasangkan dengan micropipet, dan

Micropipet digunakan untuk memindahkan dan mengambil cairan dan dalam

jumlah kecil secara akurat. Chamberwell untuk sebagai alat elektroforesis dan

menvisualisasikan genetik pada agar. Sisir chamberwell untuk membuat sumur

pada agar. UV transilluminator untuk menvisualkan DNA setekah loading atau

running dalam DNA elektroforesis. Hal ini sesuai dengan literatur dari

Harahap (2017) yang menyatakan bahwa pengukuran konsentrasi DNA dengan

spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein

diukur pada panjang gelombang 280.

Pada praktikum ini, bahan yang digunakan adalah stok DNA sebagai objek

praktikum yang akan diamati, Buffer TAE untuk mencegah struktur DNA dan

menghantar listrik yang baik saat elektroforesis, agarose sebagai bahan pemadat,

aquades sebagai bahan sterilisasi, loading dye sebagai pemberat saat uji kualitas

dan agar tidak keluar dari sumuran, larutan EtBr untuk mengikat DNA dan

menyebabkan DNA yang ada pada gel agarose dapat berpendar saat disinari UV.
 11

Hal ini sesuai dengan literatur dari Fatchiyah (2011) yang menyatakan

bahwanalisi kualitatif genom menggunakan elektroforesis pada gel agarose

merupakan metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan, dan

furifikasi fragmen DNA. Pewarna ethidium bromide digunakan sebagai alat

identifikasi fragmen DNA yang terpisah di dalam gel. Ethidium bromide akan

terikat di antar dua untai ganda DNA sehingga pita DNA dalam gel agarose akan

berpencar karna pewarna ini mengandung zat fluresen.

Adapun prinsip dari elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan

akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah

pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju

elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas. Hal ini sesuai dengan

literatur dari Setiadi(2014) yang menyatakan bahwa elektroforesis gel merupakan

salah satu teknik utama dalam biologi molekuler. Prinsip dasar teknik ini adalah

bahwa DNA, RNA atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini

molekul molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya

gerak listrik di dalam matriks gel.

Berdasarkan hasil pengamaan hasil DNA pada Gel Doc Transluminator

tampak bahwa pita DNA yang tebal. Hal ini sesuai engan literatur Hapsari (2012)

yang menyatakan bahwa pita DNA yang menggumpal (tidak menyebar)

meunjukkan konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi

utuh. Sedangkan pita DNA yang terlihat menyebar menunjukkan bahwa adanya

ikatan antar molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung,

sehingga adanya genom DNA yang terpotong menjadi bagian bagian yang lebih

kecil.
 12

KESIMPULAN

1. Uji kualitas DNA adalah suatu metode yang digunakan untuk melihat

konsentrasi dan kemurnian DNA dengan menggunakan spektrofotometer dan

elektroforesis gel.

2. Bahan yang digunakan adalah buffer TAE, stok DNA, loading dye, EtBr.

3. Alat yang digunakan adalah mikropipet, vortex, tips, power supplay.

4. Prinsip dari elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan

akanbergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah

pengaruh medan listrik.

5. Berdasarkan hasil pengamaan hasil DNA pada Gel Doc Transluminator

tampak bahwa pita DNA yang tebal.

 13

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Alex J., Julian L. 2008. Deoxyribo Nucleic Acid. Keanekaragaman,
Ekspresi, Rekayasa, dan Efek Pemanfaatannya. Bandung. Alfabeta.

Fatchiyah, E. 2011. Biologi Molekuler. Prinsip Dasar Analisis. Universitas Negeri

Jakarta

Hapsari, R. 2012. Uji Kuantitatif dan Kualitatif DNA Pule Pandak

(Rauvolfia serpentine L. ). Universitas Sebelas Maret.

Harahap A. S. 2017. Uji Kualitas Dan Kuantitas Dna Beberapa Populasi Pohon
Kapur Sumatera. Universitas Pembangunan Panca Budi, Medan .

Irawan, B. 2008. Genetika Molekuler. Universitas Airlangga. Surabaya.

Larasati. A. 2011. Analisis Tahap Pembelahan Sel Mitosis. Universitas Jendral

Soedirman. Purwakarta.

Maulidia, S. 2017. Pembuktian DNA Sebagai Materi Genetik. Universitas

Andalas.

Muhammad, R. M. 2012. Bioteknologi Tanaman. Uji Kualitas dan Kuantitas

DNA. Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

Setiadi, E., Rohmawati., Litayani., laily m. 2014. Elektroforesis Pada Gel

Agarose. Universitas Negeri Semarang.

Windiastika, 2012. Penentuan Kualitas dan Kuantitas Asam Nukleat

Menggunakan Spektrofotometer.