LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PANGAN

ELEKTROFORESIS

Nama : Muhammad Ainul Yaqin

NIM : B41221031
Golongan : B

Dosen :
Dr. Titik Budiati, S.TP., M.T., M.Sc.

Teknisi :
Wahyu Setyaji Dwiantara, S.Si.
Widya Rahmawati, S.Si.

PROGRAM STUDI TEKNOLOGI REKAYASAN PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN
POLITEKNIK NEGERI JEMBER
2024
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Elektroforesis merupakan suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, dan besar
muatan dari molekul (Titrawani, 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan
ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul
tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi
protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi
(Ricardson, 1986).
Proses interpretasi gambar DNA sendiri secara manual untuk mendapatkan
hasil yang akurat sangat susah, membutuhkan waktu, dan kemungkinan error cukup
besar (Intarapanich, 2015). Hal ini bisa disebabkan kompleksitas pergerakan molekul
DNA itu sendiri. Molekul yang bergerak dalam DNA akan berhenti pada jarak migrasi
tertentu tergantung pada muatan, bentuk, dan ukurannya (Kusumaningrum, 2014).
Sehingga, kecocokan suatu DNA dapat dianalisa berdasarkan hasil elektroforesis
DNA tersebut. Salah satu standar bahan yang digunakan dalam elektroforesis DNA
yaitu gel agarosa (Zhang, 2011). Pada DNA hasil elektroforesis gel agarosa, molekul
DNA dianalisa berdasarkan letaknya setelah mengalami migrasi pada proses
elektroforesis tersebut.
1.2 Tujuan
1. Mahasiswa mampu memahami konsep elektroforesis
2. Mahasiswa mampu melaksanakan praktikum elektroforesis
 BAB II

ALAT DAN BAHAN

2.1 Alat
1. Mikropipet 0,5-10 µL
2. Tube
3. Tip
4. Parafin film
5. Rak mikrotube
2.2 Bahan
1. Agarose 2%
2. Plasmid (Sampel)
3. DNA (Sampel)
4. Amplifikasi (Sampel)
5. TAE
6. DNA loading buffer
7. DNA ladder
 BAB III
METODE PRAKTIKUM

Persiapan Alat dan

bahan

Tambahkan Agarosa 2% Lakukan pengujian

dan dibentuk sumur elektroforesis dengan alat
cetakan elektroforesis

Ambil sampel 5 µL
keatas parafin film Lakukan pengamatan
terhadap sampel yang telah
diuji

Tambahkan DNA loading buffer

1 µL dan homogenkan
selesai

Masukkan TAE dalam Agarosa

hingga memenuhi permukaan

Masukkan sampel dan TAE yang

tercampur kedalam agarose
 BAB IV
PEMBAHASAN
4.1 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakanmolekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,
ukuran, besar muatan dan sifat kimiadari molekul (Titrawani, 1996). Pemisahan
dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium
penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein
tersebut akan mulai bermigrasi (Richardson, 1986).
Teknik elektroforesis dapat dibedakanmenjadi dua cara, yaitu : elektroforesis
larutan(moving boundary electrophoresis) danelektroforesis daerah (zone
electrophoresis).Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga yang
mengandung makro-molekulditempatkan dalam suatu kamar tertutup dandialiri arus
listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) didalam pelarut. Sedangkan
teknik elektroforesisdaerah adalah menggunakan suatu bahan padatyang berfungsi
sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga.Media penunjang
yang biasa dipakaiadalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamidadan kertas sellulose
poliasetat. Adapaun menurut Sargent (1975) elektroforesis daerah disebut
sebagaielektroforesis gel dengan dua buah model yaituhorizontal dan vertikal. Metode
yang biasadigunakan adalah model horizontal, karenamempunyai beberapa
keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana,relatif murah dan
pemisahan untuk enzimtertentu dapat menghasilkan pemisahan yanglebih baik
4.2 Tahapan Elektroforesis

Gambar 4.1 Pemindahan sampel

Pada Gambar 1.1 merupakan proses pemindahan sampel yang berupa ekstraksi
DNA, hasil amplifikasi, dan ekstraksi plasmid keatas kertas parafilm untuk
memudahkan saat mencampurkan dengan DNA loading buffer, hal ini karena sifat
kertas parafilm yang fleksibel, water resistant, termoplastik, dan kuat. Selain itu, juga
dapat mempermudah saat memasukkan kedalam sumur gel dengan mikropipet.

Gambar 4.2 Penambahan DNA loading buffer

Pada Gambar 4.2 penambahan DNA loading buffer pada sampel yang telah
diletakkan pada parafilm berfungsi sebagai
1. Meningkatkan densitas sampel
2. Memberikan warna dan berat molekul
3. Menjaga stabilitas dan integritas sampel DNA
4. Memberikan kondisi pengisian sumur yang konsisten
Penggunaan perbandingan 5:1 bertujuan untuk mengontrol konsentrasi sampel DNA
yang dimuat kedalam sumur gel

Gambar 4.3 Penambahan TAE pada gel agarose

Buffer TAE (Tris Acetate EDTA) merupakan larutan penyangga yang biasa
digunakan dalam elektroforesis. Larutan ini berfungsi untuk meneruskan arus listrik
sehingga diterima oleh fragmen DNA yang berada pada gel agarosa yang terendam
pada larutan tersebut (Ogden dan Adams, 1987). Larutan ini ditambahkan sebelum
sampel dimasukkan kedalam sumur-sumur gel agarose
 Gambar 4.4 Memasukkan sampel kedalam sumur gel

Sampel yang telah dibuat, kemudian dimasukkan kedalam sumur gel agarose
dengan perlahan agar tidak merusak sumur.
4.3 Bahan Kimia Elektroforesis
1. Agarose 2%, menurut Nugraha et al. (2014), gel agarosa memiliki kemampuan
memisahkan fragmen DNA dari ukuran beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa.
Hanya saja separasi pita amplikon yang dihasilkan gel agarosa kurang baik sehingga
perlu dilanjutkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid. Agarose adalah
polisakarida yang diekstraksi dari alga merah dan digunakan sebagai media gel dalam
elektroforesis. Dalam elektroforesis, agarose 2% digunakan untuk membuat gel
dengan pori-pori yang sesuai untuk memungkinkan migrasi DNA dengan efisien. Gel
agarose 2% memiliki kepadatan yang cukup untuk mendukung pemisahan fragmen
DNA dengan ukuran yang berbeda. Proses pembuatan gel agarose 2% melibatkan
melelehkan agarose, mencampurkannya dengan larutan buffer, menuangkan campuran
ke cetakan gel, dan membiarkannya membeku hingga solid sebelum digunakan untuk
elektroforesis
2. TAE, TAE adalah singkatan dari Tris-Acetate-EDTA, yang merupakan sebuah
buffer elektroforesis yang umum digunakan dalam biologi molekuler, khususnya
dalam elektroforesis DNA, TAE terdiri dari Tris(hydroxymethyl)aminomethane),
Asetic acid, dan Ethylenediaminetetraacetic Acid (Stellwagen, 2002)
3. DNA loading buffer, loading buffer ini berfungsi sebagai pewarna dan
meningkatkan densitas sampel sehingga fragmen tersebut berada di dasar sumur dan
tidak menyebar. Marker atau penanda yang digunakan pada elektroforesis merupakan
campuran molekul dengan ukuran berbedabeda yang digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel (Clark & Cristopher, 2008). Larutan ini terdiri dari
campuran bahan kimia seperti, buffer, glikol, Bromofenol Biru (Bromophenol Blue)
dan/atau Xilena Sianol FF (Xylene Cyanol FF), EDTA (Ethylenediaminetetraacetic
Acid) yang berfungsi untuk mempersiapkan sampel DNA sebelum dimuat ke dalam
sumur gel untuk elektroforesis
4.4 Reaksi Bahan Kimia
1. Agarose adalah polisakarida yang digunakan sebagai bahan dasar untuk membuat
gel elektroforesis. Proses elektroforesis sendiri melibatkan pergerakan molekul-
 molekul dalam gel tersebut dengan bantuan medan listrik, Tingkat resolusi atau
kemampuan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA atau protein dalam
elektroforesis agarose tergantung pada konsentrasi agarose yang digunakan.
Konsentrasi yang lebih rendah menghasilkan gel dengan pori-pori yang lebih besar,
yang biasanya cocok untuk memisahkan fragmen DNA atau protein yang lebih besar,
sedangkan konsentrasi yang lebih tinggi menghasilkan gel dengan pori-pori yang
lebih kecil, yang biasanya cocok untuk memisahkan fragmen DNA atau protein yang
lebih kecil.
2. TAE (Tris-Acetate-EDTA) adalah jenis buffer elektroforesis yang umum digunakan
dalam pemisahan DNA dalam gel agarosa. Buffer ini berperan penting dalam menjaga
kondisi yang optimal untuk pergerakan DNA dalam gel elektroforesis. Berikut adalah
beberapa reaksi yang terjadi antara TAE dan proses elektroforesis:
a. Pemeliharaan pH: Salah satu fungsi utama TAE adalah menjaga pH larutan tetap
stabil selama proses elektroforesis. Tris, sebagai komponen utama TAE, berperan
sebagai penyangga yang menetapkan pH larutan pada kisaran yang optimal untuk
pergerakan DNA. pH yang stabil sangat penting karena dapat mempengaruhi
kecepatan dan akurasi pergerakan DNA dalam gel.
b. Pengaturan Konduktivitas: TAE juga membantu dalam pengaturan konduktivitas
listrik dalam gel elektroforesis. Ini terutama dicapai melalui adanya asam asetat
dalam komposisi TAE. Pengaturan konduktivitas listrik penting untuk memastikan
pergerakan DNA yang stabil dan teratur dalam gel.
c. Stabilisasi DNA: Penambahan EDTA ke dalam TAE berperan dalam melindungi
DNA dari degradasi selama proses elektroforesis. EDTA bekerja sebagai kelat
logam yang dapat menetralkan ion logam yang dapat mengaktifkan enzim-enzim
yang merusak DNA. Ini membantu dalam menjaga integritas dan stabilitas sampel
DNA selama proses elektroforesis.
d. Pengaruh Terhadap Mobilitas DNA: Komposisi TAE, khususnya keberadaan ion-
ion dan pH yang dikontrol, dapat mempengaruhi mobilitas relatif fragmen DNA
dalam gel elektroforesis. Mobilitas DNA dalam gel dipengaruhi oleh muatan listrik
DNA, ukuran fragmen, dan kepadatan gel, yang semuanya dapat dipengaruhi oleh
kondisi TAE
3. DNA loading buffer, merupakan larutan yang digunakan untuk mempersiapkan
sampel DNA sebelum dimuat ke dalam gel elektroforesis. Reaksi yang terjadi
antara DNA loading buffer dan elektroforesis melibatkan interaksi antara
komponen-komponen dalam DNA loading buffer dengan lingkungan
elektroforesis, seperti gel agarosa atau poliakrilamida, dan buffer elektroforesis
4.5 Hasil Praktikum
Setelah diletakkan didalam sumur-sumur gel agarose, selanjutnya akan dialiri
arus listrik. Apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai
maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik
berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh
ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan
bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis
mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya (Gaffar, 2007).

Gambar 4.5 Visualisasi Gambar 4.6 Visualisasi

DNA dan amplifikasi plasmid

Hasil visualisasi produk PCR setelah elektroforesis menunjukkan adanya pita

DNA pada sampel yang berhasil diamplifikasi lokus, namun tidak semua sampel
tersebut menunjukkan ketebalan pita DNA yang sama. Hal ini dapat disebabkan
karena perbedaan konsentrasi DNA hasil ekstraksi di dalam template yang digunakan
untuk PCR serta perbedaan konsentrasi DNA yang berhasil diamplifikasi
(diperbanyak) (Sambrook & Russell, 2001). Pada gambar 4.5, terdapat dua sampel
yakni sampe ekstraski DNA yang berada disebelah kiri dan sampel hasil amplifikasi
yang berada disebalah kanan. Pada bagian kanan, sumur 2, 3, 4, dan 6 menunjukkan
konsentrasi DNA yang tinggi karena memancarkan cahaya yang terang dan tidak
menyebar, menurut Irmawati (2003) mengatakan bahwa pita DNA yang tebal dan
tunggal/mengumpul (tidak menyebar) menunjukan konsentrasi yang tinggi dan DNA
total yang diekstrak dalam kondisi utuh, sedangkan pita DNA yang terlihat menyebar
menunjukan adanya ikatan antar molekul DNA yang terputus pada saat proses
ekstraksi berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang
lebih kecil. Sedangkan pada bagian kanan, yakni hasil amplifikasi menunjukkan
bahwa ukurannya adalah 1.200 bp, hal ini ditunjukkan pada sumur 3 yang setara
dengan sampel sampel pada garis tersebut
Pada gambar 4.6 visualisasi hasil isolasi plasmid, memperlihatkan bahwa
memiliki ukuran lebih dari 1.200 bp walaupun memiliki intensitas cahaya pada pita
DNA yang rendah yang menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang rendah pula.
 BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan praktikum dan pembahasan yang telah dilakukan dapat disimpulkan
bahwa elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik. Pada hasil isolasi DNA
menunjukkan bahwa pada sumur 2, 3, 4, dan 6 memiliki konsentrasi DNA yang tinggi dan
pada hasil amplifikasi, memiliki ukuran 1.200 bp, sedangkan pada hasil isolasi plasmid
memiliki ukuran leibh dari 1.200 dengan intensitas cahaya pada pita DNA yang rendah pula
 DAFTAR PUSTAKA

Intarapanich, A., Kaewkamnerd, S., Shaw, P. J., Ukosakit, K., Tragoonrung, S., & Tongsima,
S. (2015). Automatic DNA diagnosis for 1D gel electrophoresis images using bio-
image processing technique. BMC genomics, 16(12), 1-11.
Irmawati. 2003. Perubahan Keragaman Genetik Ikan Kerapu Tikus Generasi Pertama Pada
Stok Hatchery. Thesis. Bogor: IPB
Kusumaningrum, H. P., Budi, W. S., Azam, M., & Bawono, A. (2014). Design of
electrophoresis device for Optimation of DNA visualization and dna concentration
using software. Jurnal Pendidikan Fisika Indonesia, 10(2), 194-202.
Nugraha F, Roslim DI, Ardilla YP, Herman (2014) Analisis sebagian sekuen gen Ferritin2
pada padi (Oryza sativa L.) Indragiri Hilir, Riau. Biosaintifika 6:94-103. doi:
10.15294/biosaintifika.v6i2.3102
Richardson, B. J, P. R. Baverstock and M. Adams 1986.Allozyme Electro- phoresis.A
Handbook for Animal Sys-tematics and Population Studies. Aca-demic Press, Inc. San
Diego : 410 pp
Sambrook, J, Fritsch E.F, and Maniatis,T. 1989. Molekular Cloning: A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA
Sambrook, J. & D.W. Russell. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd edition.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
Sargent, J. R., & George, S. G. (1975). Methods in zone electrophoresis.
Stellwagen, E., & Stellwagen, N. C. (2002). The free solution mobility of DNA in Tris‐
acetate‐EDTA buffers of different concentrations, with and without added
NaCl. Electrophoresis, 23(12), 1935-1941.
Titrawani, 1996. Biodiversiti Kodok Genus Rana Ditijau dari Morfologi, Kariotipdan Pola
Protein di Kodya Sawahlunto.Bogor: Program Pasca SarjanaInstitut Pertanian Bogor
Zhang, J. H., Wang, F., & Wang, T. Y. (2011). A simple and effective SuperBuffer for DNA
agarose electrophoresis. Gene, 487(1), 72-74.