NANOPHOTOMETER

Halaman: 6-10

Parameter nilai kemurnian yang dianalisis dari panjang gelombang dengan rasio 260/230 merupakan
parameter validasi sekunder yang digunakan untuk melakukan analisis mutu DNA hasil isolasi.

pemilihan parameter mutu DNA hasil isolasi yang dilakukan menggunakan nilai rasio 260/230 yang
banyak dikenal sebagai parameter sekunder dalam menentukan kualitas DNA hasil isolasi, dimana
pada parameter ini dapat melihat sumber kontaminan DNA hasil isolasi. Setidaknya ada beberapa
penyebab paling umum dari rasio abnormal dalam isolasi DNA yaitu; kontaminasi sampel oleh residu
fenol, guanidin, dan reagen lain yang digunakan dalam protokol isolasi.
Perkembangan teknik isolasi DNA melahirkan banyak kit dengan metode ekstraksi yang
membutuhkan optimasi awal sebelum metode tersebut digunakan. Keberhasilan optimasi akan
mendukung keberhasilan analisis pada saat melakukan pengujian. Optimasi dilakukan untuk
mengetahui tingkat keakuratan dan keefektifan sebuah kit yang akan digunakan. Salah satu cara
untuk mengetahui keberhasilan optimasi dalam esktraksi adalah dengan melakukan analisis mutu
DNA hasil isolasi menggunakan NanoPhotometer

Analisis kemurnian dan konsentrasi di baca menggunakan nano fotometer dengan mengukur nilai
absorban pada panjang gelombang A260/A280. Penggunaan panjang gelombang A260/A280
merupakan metode umum dalam mendeteksi nilai konsentrasi dan kemurnian DNA
dari 5 komposisi nukleotida penyusun DNA atau RNA jika dibaca absorbansinya pada panjang
gelombang A260/A280 akan menunjukan nilai yang bervariasi, yaitu: guanine (1.15), adenin (4.50),
sitosin (1.51), urasil (4.00) dan timin (1.47). Hasil analisis kemurnian yang dihasilkan dari pembacaan
absorbansi merupakan rata-rata dari nilai absorbansi empat atau lima asam nukleat ini. Inilah yang
menjadi dasar penetapan nilai kemurnian ummnya untuk analisis DNA berada pada kisaran (1.8-2.0)

untuk pengukuran DNA secara kuantitatif dilakukan dengan menggunakan nanodrop

spektrofotometri dengan perbandingan absorbansi pada 260/280.
untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu
pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet
Nanodrop adalah alat yang memiliki prinsip dengan menghitung perbedaan penyerapan cahaya UV
dimana pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm sedangkan kontaminan berupa
protein dan fenol akan menyerap cahaya dengan panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA dapat
diukur dengan rasio absorbansi terhadap panjang gelombang 260 nm dan 280 nm, kemurnian DNA
yang baik adalah 1,8-2,0. Berdasarkan penelitian Hikmatyar et al., (2015) menggunakan
spektrofotometer nanodrop didapati nilai rata-rata kemurnian DNA adalah 1,89 dan pada penelitian
Hairudin (2013) didapati kemurnian DNA dengan angka rata-rata 1,96.

konsentrasi DNA rata-rata yang diuji dengan Spektrofotometer Nanodrop sebesar 60,304 ng/µl.
Rendahnya konsentrasi yang diperoleh dari pengujian dengan Spektrofotometer Nanodrop dapat
disebabkan karena spesifisitas alat tersebut tidak terlalu tinggi, karena pada panjang gelombang 260
nm
halaman: 6-10

Halaman: 1-6
ELEKTROFORESIS GEL

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan
seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama
dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

DNA hasil isolasi selanjutnya dilakukan cek kuantitas dan kualitas untuk melihat konsentrasi dan
kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis gel

Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal elektroforesis, pengecekan hasil isolasi DNA pada gel
agarose. Pengukuran konsentrasi DNA dengan spektrofotometer dilakukan pada panjang gelombang
260 nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280. Kemurnian larutan DNA dapat
dihitung melalui perbandingan A260 nm dengan A280 nm. Batas kemurnian yang biasa dipakai
dalam analisis molekuler pada rasio A260/A280 adalah 1,8-2,0

HALAMAN: 1-6
Pengukuran DNA secara kualitatif pada 17 aksesi tanaman Keladi tikus dilakukan dengan
menggunakan elektroforesis gel agarosa dan diperiksa di bawah UV transilluminator.

Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan listrik yang
dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang memiliki muatan
berupa kation ataupun anion. Elektroforesis membutuhkan media pemisah berupa fase diam seperti
sel Agarosa yang tercampur larutan buffer untuk menjaga kondisi keasaman sampel saat proses
pemisahan.

Isolasi DNA digunakan untuk berbagai macam

keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis maupun spektrofotometri. Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat
Keberhasilan proses isolasi DNA
dapat diukur melalui beberapa proses, di antaranya
adalah melalui pengecekan keberadaan band DNA
dengan metode elektroforesis.
Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis
horizontal melalui media gel agaros.
Prinsip dasar elektroforesis adalah pergerakan
molekul bermuatan atau ion melalui medium semisolid

di bawah pengaruh suatu medan listrik.

Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui
ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang
sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi
sebagai pembanding sehingga bisa diketahui
perkiraan ukuran DNA sampel. Jika molekul yang
bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui gel
agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub
ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif, sehingga elektroforesis dapat memisahkan
DNA berdasarkan ukuran panjangnya

Secara prinsip, elektroforesis DNA merupakan

teknik untuk memisahkan sampel DNA

berdasarkan atas ukuran berat molekul dan
struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan

antara lain agarosa. Elektroforesis

gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan

sampel DNA dengan ukuran dari

beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik

analisis penting dan sangat sering dipakai
dalam bidang biokimia dan biologi molekuler.

Penelitian menggunakan gel agarose dengan konsentrasi 1%. Konsentrasi gel agarose sangat
mempengaruhi laju migrasi DNA pada proses elektroforesis. Hal ini sesuai dengan penelitian Fatciyah
(2011) dimana konsentrasi agarose yang digunakan akan menentukan besarnya pori-pori gel yang
akan memisah-misahkan DNA. Semakin rendah konsentrasi agarose maka matriks gel akan semakin
kecil dan fragmen DNA dapat dipisah semakin jauh berdasarkan ukurannya. DNA yang sudah di
ekstraksi langsung di elektroforesismelalui gel agarose dimana untuk melihat dan memperjelas ada
atau tidaknya pita DNA dari sampel yang di uji. Hasil positif gel agarosa adalah munculnyapita yang
berpendar jika gel dilihat di bawah sinarultraviolet. Hasil negatif elektroforesis gel agarosaadalah
tidak adanya pita yang berpendar jika gelagarosa dilihat di bawah sinar UV