ISOLASI RNA DARI WHOLE BLOOD DAN PENENTUAN KUALITAS RNA

MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER DAN ELEKTROFORESIS AGAROSE

A. Pendahuluan
Ekstraksi biomolekul, seperti DNA, RNA, atau protein merupakan metode dasar
yang penting pada keilmuan biologi molekuler. Tahapan ini, adalah langkah awal dalam
suatu proses penelitian maupun diagnostik. Umumnya, materi genetik RNA dapat
diekstraksi dari bahan biologis, misalnya jaringan, darah, serum, plasma, urin dan
bahkan mikroorganisme lainnya (bakteri, virus, parasit). Dalam proses isolasi RNA, terjadi
pemisahan materi genetik dari dalam sel sehingga didapatkan RNA murni yang telah
terpisah dari DNA, debris sel, maupun sisa-sisa reagen solasi. Berikut empat tahapan
umum yang terjadi dalam proses isolasi materi genetik.

1. Lysis : Proses pemecahan sel sehingga RNA dapat keluar

2. Binding : Proses pengikatan RNA sehingga dapat terpisah dari materi pengotor lainnya
3. Washing : Tahapan pencucian materi genetik RNA agar terpurifikasi
4. Elution : Tahapan resuspensi untuk melarutkan RNA.

Kemurnian hasil ekstraksi RNA merupakan faktor utama yang menentukan

keberhasilan dalam downstream analysis, baik untuk tujuan penelitian maupun tujuan
analisis klinis atau diagnosis. Oleh karena itu, penting untuk dilakukan quality control
(QC) atau manajemen mutu terhadap hasil ekstraksi RNA. Pengujian terhadap mutu
RNA dapat dilakukan secara kualitatif menggunakan teknik elektroforesis gel agarose
dan secara kuantitatif menggunakan alat spektrofotometer.
Prinsip elektroforesis adalah pemisahan molekul RNA berdasarkan pada
ukurannya. Pada sel eukariot akan dihasilkan 2 buah pita RNA, yaitu 28s rRNA dan 18S
rRNA. Keduanya merupakan komponen utama RNA di dalam sel, jumlahnya hampir
80% dari total RNA. Dengan teknik elektroforesis, dapat diketahui integritas (utuh atau
tidak) RNA berdasarkan bentuk dari hasil visualisasi di bawah sinar UV. Jika terbentuk
pita RNA yang smear atau berbayang maka berarti RNA telah
terdegradasi/terfragmentasi. Jika
terbentuk pita berjumlah lebih dari dua dan dengan ukuran besar, maka dapat dicurigai
telah terjadi kontaminasi DNA genom.
Penggunaan spektrofotometer UV dapat dilakukan dalam 2 mode, yaitu mode
konvensional dan mode modern. Spektrofotometer konvensional menggunakan kuvet
berukuran besar (sekitar 1,5-2 ml) sehingga volum RNA yang diperlukan juga banyak.
Dengan menggunakan spektrofotometer konvensional, dapat ditentukan konsentrasi
RNA dengan rumus sebagai berikut: [RNA] = Å260 x 40 x faktor pengenceran. Å260
merupakan nilai absorbansi sampel pada λ 260 nm. Selain menghitung konsentrasi,
dapat juga ditentukan kemurnian RNA dengan melihat rasio Å260/Å280 serta rasio
Å260/Å230. RNA dikatakan terbebas dari kontaminan protein jika nilai rasio Å260/Å280
antara 1,8- 2,0. Sedangkan RNA dikatakan bebas dari kontaminasi dari garam (fenol,
guanidine dan semacamnya) jika nilai rasio Å260/Å230 antara 2,0-2,2. Rasio tersebut
dihitung secara manual, yaitu dengan cara menentukan absorbansi sampel pada 3
panjang gelombang, yaitu 230, 260, dan 280 nm. Lain halnya dengan alat
spektrofotometer modern, dimana penggunaan alat ini jauh lebih mudah. Hal ini karena
hanya membutuhkan sedikit sampel (kisaran 1-2 µl), serta nilai rasio Å260/Å280 serta
rasio Å260/Å230 ditentukan secara otomatis oleh alat.

B. Tujuan Praktikum
Mahasiswa mampu melakukan isolasi RNA dari spesimen whole blood menggunakan
metode column dan melakukan evaluasi terhadap kualitas RNA hasil isolasi

C. Alat dan Bahan

Bahan
1. spesimen whole blood
2. kit ekstraksi RNA
3. kloroform
4. agarose
5. intercalating dye
6. loading dye
 7. buffer TAE 1X
Consumable habis pakai
1. pipet tip (10, 200, 1000 µl)
2. parafilm
3. tabung mikrosentrifuge 1,5 ml
4. alumunium foil
5. pulpen marker
Alat
1. sentrifugator dingin
2. sentrifugator suhu ruang
3. pipet mikro
4. vortex
5. NanoDrop 2000, Thermo Scientific
6. apparatus elektroforesis
7. erlenmeyer
8. neraca analitik
9. microwave
10. UV Transilluminator
11. timer

D. Prosedur
Praktikum Ekstraksi
RNA
Protokol ekstraksi sesuai dengan kit Hybrid-R Blood RNA (Ver.1.1), dengan tahap-
tahap sebagai berikut:

1. Siapkan 750 ul RiboExTM LS dalam tabung mikrosentrifuge 1,5 ml.

2. Tambahkan sampel darah 400 µl ke tabung mikrosentrifuge 1,5 ml dan

lakukan vortex.
3. Diinkubasi selama 2 menit pada suhu ruang.

4. Tambahkan 200 µl chloroform. Lakukan vortex selama 15 detik dan diamkan

 selama 2 menit di suhu kamar.
5. Sentrifuge pada 12.000 x g, 4o C selama 15 menit.
6. Bagian cairan p a l i n g a t a s yang bening (sekitar 400 µl) dimasukkan ke
dalam EzPureTM filter (filter berwarna kuning).
7. Sentrifuge ≥ 10,000 x g selama 30 detik pada suhu ruang untuk menurunkan
larutan, lalu buang filter bagian atas dan sisakan tabung koleksi yang telah
berisi larutan

8. Tambahkan 2 kali volum (jika terambil 400 µl cairan bening maka ditambah
800 µl) buffer RBI ke dalam tabung koleksi dan homogenkan menggunakan
pipet (pipetting up and down).
9. 700 µl larutan dari tahap nomor 8 dimasukkan ke mini spin column (filter
berwarna biru).
10. Sentrifuge 12.000 x g selama 30 detik pada suhu ruang.
11. Tahap nomor 9-10 diulangi lagi dengan menggunakan larutan yang tersisa.

12. Tambahkan 500 µl buffer RBW ke dalam mini spin column.

13. Sentrifuge 12.000 x g selama 30 detik pada suhu ruang.
14. Tambahkan 500 ul buffer RNW ke dalam mini spin column.

15. Sentrifuge 12.000 x g selama 30 detik pada suhu ruang.

16. Sentrifuge 12.000 x g lagi selama 1 menit pada suhu ruang untuk
menghilangkan sisa buffer. Pindahkan mini spin column ke tabung
mikrosentrifuge 1,5 ml baru, sementara tabung koleksi dibuang
17. Tambahkan 50 µl Nuclease-free water di bagian tengah membran mini spin
column untuk elusi.
18. Sentrifuge 12.000 x g selama 1 menit pada suhu kamar.
19. Kualitas RNA diukur secara kualitatif dengan elektroforesis agarose dan
kuantitatif dengan spektrofotometer

Spektrofotometer
Spektrofotometer dilakukan menggunakan NanoDrop 2000 Thermo Scientific.
 1. Hidupkan alat
2. Lakukan pengukuran blanko menggunakan pelarut yang digunakan pada
tahap elusi
3. Lakukan pengukuran konsentrasi dengan mengambil 1 µl sampel RNA dan
diletakkan di atas pedestal alat
4. Klik “measure” untuk mulai mengukur konsentrasi
5. Catat konsentrasi, nilai rasio 260/280, dan nilai rasio 260/230

Elektroforesis Agarose
Elektroforesis menggunakan gel agarose 1,5% dan di running dengan tegangan
80 volt dan waktu 60 menit
1. Siapkan gel agarose (telah disiapkan oleh fasilitator)
2. Siapkan kertas parafilm untuk media pencampuran sampel RNA dengan
loading dye
3. Ambil 3 µl loading dye dan letakkan di atas kertas parafilm
4. Campurkan 5 µl sampel RNA dengan loading dye pada kertas parafilm
5. Masukkan (total 8 µl) campuran tersebut ke dalam sumuran gel agarose
(catat di sumuran ke berapa sampel anda masuk)
6. Hidupkan power supply dan atur sesuai kondisi yang diinginkan, lalu tunggu
sampai prosesnya selesai
7. Setelah selesai, lakukan pengamatan hasil di bawah sinar UV
8. Dokumentasikan hasilnya

E. Hasil Praktikum
1 Konsentrasi RNA hasil isolasi A1A: 47,4 ng/µl
A1B:42,8 ng/µl

2 Nilai rasio Å260/Å280 A1A: Sesuai rentang / tidak sesuai rentang*

Interpretasi: murni / terkontaminasi protein*
A1B: Sesuai rentang / tidak sesuai rentang*
Interpretasi: murni / terkontaminasi protein*
3 Nilai rasio Å260/Å230 A1A: Sesuai rentang / tidak sesuai rentang*
 Interpretasi: murni / terkontaminasi garam*
A1B: Sesuai rentang / tidak sesuai rentang*
Interpretasi: murni / terkontaminasi garam*

4 Interpretasi hasil A1A: RNA utuh / RNA terdegradasi / ada

elektroforesis kontaminasi DNA*
A1B: RNA utuh / RNA terdegradasi / ada
kontaminasi DNA*
5 Kesimpulan akhir Hasil pemeriksaan A1A dan A1B memiliki hasil yang
bagus tetapi A1A memiliki sedikit DNA di dalamnya
 T042 ‐ TECHNICAL BULLETIN NanoDrop Spectrophotometers
Assessment of Nucleic Acid Purity
Introduction
Nucleic acids and proteins have absorbance maxima at 260 and
280 nm, respectively. Historically, the ratio of absorbances at
these wavelengths has been used as a measure of purity in both
nucleic acid and protein extractions. A ratio of ~1.8 is
generally accepted as “pure” for DNA; a ratio of ~2.0 is
generally accepted as “pure” for RNA.
Similarly, absorbance at 230 nm is accepted as being the result
of other contamination; therefore the ratio of A260/A230 is
frequently also calculated.. The 260/230 values for “pure”
nucleic acid are often higher than the respective 260/280
values. Expected 260/230 values are commonly in the range
of 2.0-2.2.
Residual chemical contamination from nucleic acids extraction
procedures may result an overestimation of the nucleic acid
concentration and/or negatively influence downstream
analysis. Shown below (fig. 1) are example spectra for 4
common extraction reagents which, if not properly cleaned up,
will affect sample purity.
FIGURE 1. Spectra of reagents used in the isolation of nucleic acids.
A) TriZol B) Phenol C) Guanidine HCL and D) Guanidinium
isocyanate
Thermo Fisher Scientific – NanoDrop Products Wilmington, Delaware USA
Contaminant Identification
Examination of sample spectra may be useful in identifying
that a problem with sample purity exists. It is recommended
that the following be reviewed after each sample measurement:
• 260/230 ratio – a low ratio may be the result of a
contaminant absorbing at 230 nm or less.
• 260/280 ratio – a low ratio may be the result of a
contaminant absorbing at 280 nm or less.
• Wavelength of the trough in sample spectrum– this should
be at ~230 nm. Absorbance by a contaminant at a low
wavelength will typically shift the wavelength of the
trough. Refer to Figure 2.
• Wavelength of the peak in sample spectrum– this should
be at 260 nm. Absorbance by a contaminant may shift the
peak absorbance wavelength. Refer to Figure 2.
260/230 Ratios
Some contaminants have characteristic profiles, e.g. phenol,
however many contaminants present similar characteristics:
absorbance at 230 nm or less. Abnormal 260/230 values
may indicate a problem with the sample or with the
extraction procedure, so it is important to consider both.
A low A260/A230 ratio may be the result of:
• Carbohydrate carryover (often a problem with plants).
• Residual phenol from nucleic acid extraction.
• Residual guanidine (often used in column based kits).
• Glycogen used for precipitation.
A high A260/A230 ratio may be the result of:
• Making a Blank measurement on a dirty pedestal
• Using an inappropriate solution for the Blank
measurement. The blank solution should be the same pH
and of a similar ionic strength as the sample solution.
Example: Using water for the Blank measurement for
samples dissolved in TE may result in low 260/230
ratios.
Technical support: info@nanodrop.com 302-479-7707 www.nanodrop.com
2
TECHNICAL NOTE
260/280 Ratios
Abnormal 260/280 ratios usually indicate that the sample is
either contaminated by protein or a reagent such as phenol
or that there was an issue with the measurement.
A low A260/A280 ratio may be caused by:
• Residual phenol or other reagent associated with the
extraction protocol
• A very low concentration( > 10 ng/ul).of nucleic acid
High 260/280 purity ratios are not indicative of an issue.
Although purity ratios and spectral profiles are important
indicators of sample quality, the best indicator of DNA or RNA
quality is functionality in the downstream application of
interest. If the purity ratio is significantly higher than
expected, it is best to review the spectral profile as a
primary means of troubleshooting.
It is important to note that there are occasions when the purity
ratios are within expected limits, yet there is a problem with
the sample.
Shifts in Spectral Profile
FIGURE 2. Spectra of purified DNA without contamination (A), and
of the same DNA sample contaminated with guanidine (B) and
phenol (C).
Thermo Fisher Scientific – NanoDrop Products Wilmington, Delaware USA
NanoDrop Spectrophotometers
Change in 260/280 Ratios
Some researchers encounter a consistent 260/280 ratio change
when switching from a standard cuvette spectrophotometer to
a NanoDrop Spectrophotometer. The two main explanations
for this observation are listed below:
• Change in sample acidity: Small changes in the pH of
the solution will cause the 260/280 to vary (1). Acidic
solutions will under-represent the 260/280 ratio by 0.2-
0.3, while a basic solution will over-represent the ratio by
0.2-0.3. If comparing results obtained using a NanoDrop
Spectrophotometer to results obtained using other
spectrophotometers, it is important to ensure that the
pH of an undiluted sample measured on our instruments is
at the same pH and ionic strength as the diluted sample
measured on the conventional spectrophotometer.
• Wavelength Accuracy of the Spectrophotometers
Although the absorbance of a nucleic acid at 260 nm is
generally on a plateau, the absorbance curve at 280 nm is
quite steeply sloped. A slight shift in wavelength accuracy
will have a large effect on 260/280 ratios. It is possible to
see as much as a 0.4 difference in the 260/280 ratio when
measuring the same nucleic acid sample on two
spectrophotometers that are both within a 1 nm
wavelength accuracy specification.
Conclusion
The use of a Thermo Scientific NanoDrop spectrophotometer
to QC nucleic acid samples can result in significant savings in
time and money. The micro volume capability of
NanoDrop™ spectrophotometers allow the researcher to
quickly and easily run quality control checks of nucleic acid
and protein samples. In addition, the instrument’s short
measurement cycle and general ease of use greatly increases
the rate at which samples can be processed, making it possible
to implement multiple quality control checks throughout a
procedure or process.
Reference
1) William W. Wilfinger, Karol Mackey, and Piotr Chomczynski,
Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric
Assessment of Nucleic Acid Purity: BioTechniques 22:474-481
(March 1997)
T042 Rev 1/11
Technical support: info@nanodrop.com 302-479-7707 www.nanodrop.com