LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI

MOLEKULER 2

Isolasi RNA dan Sintesis cDNA

Nama : Rihadatul Aisya Zahra

NIM : 2210343008

Program Studi S1 Ilmu Biomedis

Fakultas Kedokteran
Universitas Andalas
Padang
2023
 Isolasi RNA dan Sintesis cDNA

Tujuan
1. Mahasiswa mengetahui prinsip isolasi RNA
2. Mahasiswa mengetahui cara isolasi RNA yang benar
3. Mahasiswa memahami untuk apa RNA di isolasi
4. Mahasiswa mengetahui prinsip sintesis cDNA
5. Mahasiswa mengetahui cara isolasi RNA yang benar
6. Mahasiswa memahami untuk apa sintesis cDNA

Teori Percobaan (Praktikum Isolasi RNA DAN Sintesis cDNA )

Molekul RNA adalah polimer panjang yang tidak bercabang dari gugus
ribonukleotida monofosfat yang digabungkan dengan ikatan fosfodiester.
Secara kimia dan biologi, molekul RNA bersifat tidak stabil terutama pada
suhu tinggi dan dalam keadaan basa. RNA memiliki bentuk pita tunggal dan
tidak berpilin. Proses pembentukan RNA berkaitan erat dengan fungsi DNA,
yang mana RNA yang merupakan hasil transkripsi dari suatu fragmen DNA.
Dengan kata lain, DNA berperan penting dalam tahapan pembentukan RNA
dengan membawa informasi genetik berupa berupa kode-kode sandi atau
genetik pada untai ganda DNA untuk dicetak membentuk RNA.

Isolasi adalah prosedur yang digunakan untuk memisahkan suatu dari

bagian lain dengan tujuan tertentu (Singleton & Sainsbury 2006: 409). Isolasi
RNA digunakan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan RNA
murni. Secara umum terdapat tiga dasarpersyaratanisolasi RNA, yaitu
melisiskan membran sel untuk mengekspos RNA, pemisahan RNA dari zat-
zat dan molekul lainnya seperti DNA, lipid, protein, dan karbohidrat, dan
pemulihan RNA dalam bentuk murni (Dale & Schantz 2002: 31--33; Nicholl
2002: 27).

RNA mudah terdegradasi dengan cepat karena adanya enzim ribonuklease

dalam sel dan jaringan, atau dari eksogen. Setelah mendapatkan RNA total
hasil ekstraksi, RNA tersebut dapat digunakan sebagai cetakan untuk proses
sintesis complementary DNA (cDNA). Mirip dengan RNA, cDNA hanya
berisi exon. cDNA memiliki sifat yang lebih stabil dibandingkan dengan RNA
sehingga mudah untuk dianalisis.
cDNA (dari complementary DNA), merupakan DNA untai tunggal (single-
stranded) sintetik/buatan yang disalin dari untai mRNA menggunakan mesin
PCR dengan memanfaatkan enzim. Penggunaan cDNA ini sangat luas,
terutama dalam analisis ekspresi genetik dan transkriptomika. mRNA berkas
tunggal atau transkriptom bersifat tidak stabil karena mudah dicerna dan
dilebur dalam sel. Pengubahan mRNA berkas tunggal menjadi cDNA
membuatnya lebih mudah dianalisis karena DNA lebih stabil (tidak mudah
dilebur). Untuk mendapatkan cDNA, diperlukan enzim reverse transcriptase
dan primer oligo dT, kemudian cDNA
diamplifikasi melalui PCR untuk mendapatkan ekspresi gen tertentu yang kita
inginkan.

Alat dan Bahan

No. Bahan Alat

1 Genezol Microsentrifuge

2 Isopropanol Tip filter 200 dan 10 uL

3 Chloroform Mikropipet 1000 uL, 200uL, 10uL

4 Etanol 70%

5 Darah EDTA/heparin

6 1,5 mL Microtube RNAse free

7 dNTPS

Prosedur Kerja
A. Isolasi RNA
1. Masukkan 300 ul Darah kedalam microtube 1.5 mL
2. Tambahkan 600 ul Genezol (3x volume darah)
3. Vortex, inkubasi 5 menit suhu kamar
4. Tambahkan 200ul chlorororm, homogenkan dengan cara dibolak-balik selama
10 detik
5. Sentrifus 13.000 x g selama 15 menit, pada suhu 4˚C
6. Ambil Aqueous phase, pindahkan ke 1.5 mL tube baru
7. Tambahakan isopropanol sebanyak (1:1) volume aqueous phase
8. Inkubasi 10 menit pada suhu dingin
9. Sentrifus 13.000 x g selama 15 menit, pada suhu 4˚C
10. Buang cairan supernatan, tambahkan 500 ul etanol 70%, bolak balik tube
beberapa kali
11. Keringkan pellet dengan heat block atau kering angin
12. Larutkan pellet RNA dengan NFW 40ul (sesuaikan dengan ukuran pellet
yg diperoleh)
13. Nanodrop
Tambah 300 ul Tambah 600 ul Vortex
darah Genezol

Inkubasi 5 menit di Tambah 200 ul Sentrifus 13.000 g

suhu kamar Choloroform 15 menit 4 celcius

Ambil Aqueous Inkubasi pada suhu Sentrifus 13.000 g

Phase dan tambah dingin 10 menit 15 menit 4 celcius
isopropanol
 Buang Supernatan Tambahkan 500 ul Larutkan dengan
Etanol 70% NFW 40 ul

Berdasarkan hasil nanodrop sampel isolasi RNA, didapatkan hasil sebagai berikut

Sampel 5A : Konsentrasi asam nukleat : 349 1

260/280 : 1,96

Sampel 5 : Konsentrasi asam nukleat : 371 4

260/280 : 1,87

Kadar kemurnian yang optimal adalah : 260/280 = 1,8-2,0

KESIMPULAN

1. Tujuan isolasi RNA adalah untuk ekspresi gen karena hanya membutuhkan
exon maka harus RNA lah yang hanya memiliki exon murni.
 2. Perbedaan isolasi RNA dengan DNA, pada isolasi DNA tidak memakai trizol
3. Genezol untuk melisikan membran, chloroform untuk melarutkan membrane,
isopropanol untuk mengikat air sehingga terdapat presipitat, dan etanol untuk
mencuci sampel (memurnikan RNA)
4. Rasio 260/280 yang terlalu tinggi menunjukkan adanya kontaminan pengotor
selain RNA pada sampel

PERTANYAAN

1. Untuk pengujian apakah template isolat RNA dilakukan?

Jawab : untuk ekspresi gen (RT-PCR)
2. Apakah bisa langsung menggunakan isolat RNA untuk diproses ke tahapan
PCR?
 Jika bisa, pada kondisi bagaimana ?
Jawab : jika menggunakan kit khusus
 Jika tidak langsung digunakan apa yang dilakukan selanjutnya?
Jawab : maka harus isolasi RNA yang kemudian akan dijadikan cDNA
melalui Reverse Transcriptase PCR