LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER
ISOLASI DNA TANAMAN

Nama : Nur Afni Helia Dewi

NIM : 191810401002

Laboratorium Bioteknologi
Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Jember
2020
I. Judul : Isolasi DNA Tanaman.

II. Tujuan Praktikum : Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA pada

tanaman.

III. Alat dan Bahan

3.1 Alat : 1. Mortar
2. Inkubator
3. Eppendorf
4. Sentrifuge
5. Vortex
6. Mikropipet
7. Mikrotube
8. Mikrotip
9. UV transiluminator
10.Elektroforesis dan Vacum dry

3.2 Bahan : 1. Sampel daun

2. Nitrogen cair
3. Buffer ekstraksi
4. SDS 20%
5. β-mercaptoethanol
6. Potassium asetat
7. Isopropanol
8. Buffer TE
9. RNA-ase
10. Phenol-chloroform isoamil alcohol (PCI)
11. Chloroform dan Choroform equal volume
12. Sodium asetat
13. Etanol 70%
IV. Skema Kerja
Digerus sampel daun, ditambahkan nitrogen cair dan buffer ekstraksi

Divortex, ditambah mercaptoetanol dan SDS 20% 50 µl

Diinkubasi 65ºC, 10 menit

Ditambahkan potassium asetat 500 µl, diinkubasi on ice, 10 menit

Disentrifus, 10.000 rpm, 4ºC, 10 menit

Dipindahkan supernatant ke tube baru, diinkubasi 20º, 10 menit

Ditambahkan isopropanol 0,25 µl, diswirling

Disentrifus 10.000 rpm, 4ºC, 10 menit

Diambil pellet, ditambahkan buffer TE 500 µl dan RNA-ase 15µl

Diinkubasi 37ºC, 1 jam, ditambahkan phenol-chloroform isoamil alcohol

 Disentrifus, 10.000 rpm, 4 ºC, 10 menit, supernatant dipindah ke tube baru

Ditambahkan chloroform equal volume, disentrifus 10.000 rpm, 4 ºC, 10 menit

Dipindahkan supernatant ke tube baru, ditambahkan chloroform equal volume

Disentrifus, 10.000 rpm, 4 ºC, 10 menit, supernatant dipindah ke tube baru

Ditambahkan isopropanol dan sodium asetat, diinkubasi -20ºC, 1 jam

Disentrifus, 10.000 rpm, 4 ºC, 10 menit, dicuci dengan ethanol 70% 1 ml

Disentrifus, 10.000 rpm, 4 ºC, 10 menit, divacum dry, dilarutkan pada buffer TE

Hasil

V. Hasil dan Pembahasan

5.1 Hasil
Hasil yang didapat pada acara isolasi DNA tanaman berupa pellet yang
diduga mengandung DNA tanaman.

5.2 Pembahasan
Praktikum kali ini dengan acara isolasi DNA pada tanaman akan
membahas mengenai proses isolasi DNA tanaman serta fungsi dari setiap
perlakuan. Bahan yang digunakan pada acara ini adalah sampel daun, nitrogen
cair, buffer ekstraksi, SDS 20% dan lain-lain . Alat yang gunakan yaitu mortar,
inkubator, mikropipet, sentrifugasi dan lain-lain.
Isolasi DNA adalah langkah awal yang digunakan dalam studi genetika
dan molekuler pada suatu spesies. Proses yang dibutuhkan adalah preparasi
sampel dalam mendapatkan DNA dengan kualitas baik. DNA dapat diisolasi baik
dari sel mikrob, sel hewan dan sel tumbuhan. Isolasi DNA terdapat beberapa
tahapan yaitu isolasi sel, lisis dinding dan membrane sel, ekstraksi dalam larutan,
purifikasi dan presipitasi. Prinsip dalam melakukan isolasi DNA yaitu sentrifugasi
dan presipitasi (Hariyadi et al, 2018).
Menurut Sambrook et al (1989), Pengambilan DNA pada makhluk hidup
terbagi atas beberapa tahapan yaitu penghancuran sel, penghilangan RNA dan
protein serta pemurnian dan pengendapan DNA. Isolasi DNA pada sel tanaman
dan sel hewan cukup berbeda, yang dapat dilihat dari struktur selnya. Menurut
Ferniah dan Pujiyanto (2013), Sel tanaman dilindungi oleh dinding sel yang kuat
dan membrane sel. Dinding sel tersusun atas polisakarida dan pada membrane sel
terdiri atas ikatan protein dan lemak. Dinding sel dan membrane sel pada sel
tanaman harus dipecah terlebih dahulu untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel.
Penghancuran sel dapat dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi maupun
enzimatik..

DNA dapat ditemukan pada organel nucleus, mitokondria dan kloroplas.

Ketiga organel tersebut memiliki bentuk DNA yang berbeda-beda. Nukleus
memiliki DNA berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat terhadap protein
histon. DNA mitokondria dan kloroplas memiliki bentuk sirkular karena tidak
berasosiasi terhadap protein histon. Dilihat dari organismenya DNA pada
prokariot memiliki bentuk sirkular karena tidak ada protein histon sedangkan pada
eukariot memiliki bentuk DNA linear karena terdapat histon (Sambrook et al,
1989).

Penghancuran dinding sel dan membrane sel pada sampel daun yang telah
ditimbang akan dilakukan secara mekanik yaitu penggerusan dengan nitrogen
cair, kemudian dilakukan secara kimiawi dengan penambahan buffer ektraksi,
Menurut Amelia et al (2013), Penambahan buffer ekstaksi berfungsi dalam
menjaga pH dalam sel dan struktur DNA sel serta tekanan osmosis sel dengan
menyediakan ion organik maupun air yang penting bagi sel. Menurut Ferniah dan
Pujiyanto (2013), Preparasi sel tumbuhan dilakukan pelisisan mekanik yaitu
penggerusan untuk mendapatkan ekstrak sel yang halus dengan penambahan
nitrogen cair yang sangat diperlukan dalam membantu proses pelisisan sel
tumbuhan. Tahap selanjutnya yaitu proses menghomogenkan dengan vortex dan
penambahan mercaptoethanol serta SDS 20%. Menurut Hadieoetomo (1990),
vortex berfungsi dalam proses homogenisasi cairan dalam gerakan vertical dengan
menggerakkan driveshaft sehingga cairan akan teraduk sempurna. Penambahan
larutan mercapthoethanol berfungsi dalam presipitasi golongan non DNA.
Menurut Lodhi et al (1994), Mercapthoethanol dapat berfungsi dalam
menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dimana akan terjadi pembentukan
ikatan hydrogen dengan senyawa polifenol sehingga DNA akan terpisah.
Penambahan SDS 20% digunakan untuk membantu dalam merusak dinding sel
secara optimal. Menurut Switzer (1999), Proses pelisisan sel pada umunya
menggunakan Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) yang digunakan untuk pelisisam
membrane sel dan dapat dengan mengurangi aktivitas dari enzim nuklease.
Tahap selanjutnya yaitu inkubasi pada suhu 65ºC selama 10 menit, hal ini
dilakukan agar memaksimalkan aktivitas dari penambahan larutan sebelumnya.
Menurut Sulistyarsi et al (2016), inkubasi dilakukan agar dapat mempertahankan
atau memelihara sel dengan mengatur suhu dan waktu tertentu agar tetap bisa
bertahan. Sentrifugasi juga dilakukan agar di dapatkan pellet dan supernatant
sebagai uji selanjutnya. Menurut Menurut Istianah et al (2018), Sentrifugasi
digunakan sebagai proses pemisahan dimana terdapat gaya sentrifugal dengan
gerakan yang cepat pada partikel padat (solid), sehingga partikel solid tersebut
akan terpisah dengan cairan (liquid) secara perlahan pada sampel. Menurut
Cappuccino dan Sherman (2002), Sentrifugasi bekerja berdasarkan massa jenisnya
melalui proses pengendapan sehingga akan didapatkan 2 fasa yaitu fasa endapan
(pellet) dan fasa ringan (supernatan). Penambahan larutan potassium asetat
sebanyak 500 µl dilakukan agar dapat mengikat protein sehingga DNA yang
didapatkan akan berkualitas baik. Menurut Das dan Dash (2015), potassium asetat
dapat berfungsi dalam mengendapkan komponen selular sel dan dapat berikatan
dengan SDS menjadi Potassium Dodesil Sulfat (KDS) dimana kontaminan protein
dapat mudah dibuang.
Tahap berikutnya adalah inkubasi on ice selama 10 menit dalam
memaksimalkan reaksi pada potassium asetat, kemudian dilakukan sentrifugasi
kembali. Hasil dari sentrifugasi yaitu supernatant akan dipindahkan ke tube baru
dan ditambahkan larutan isopropanol sebagai mepresipitasi DNA, serta dilakukan
diinkubasi dengan suhu 20ºC selama 10 menit. Menurut Syafaruddin et al (2011),
Larutan isopropanol bertujuan dalam mengumpulkan atau mengendapkan DNA
dan memisahkan dari garam-garam mineral yang tersisa. Pemberian perlakuan
sentrifugasi dilakukan kembali selama 10 menit dengan hasil yang digunakan
adalah pellet karena DNA telah diendapkan dengan penambahan larutan
isopropanol. Langkah berikutnya yaitu penambahan buffer TE dan RNA-ase, hal
ini dilakukan agar menjaga kondisi DNA yang didapatkan serta mengdegradasi
RNA dengan bantuan RNA-ase. Menurut Farmawati et al (2015), Buffer TE
digunakan sebagai pengelusi sehingga DNA lepas dan berada pada supernatant
nantinya. Menurut Ferniah dan Pujiyanto (2013), Penambahan RNA-ase
dilakukan agar dapat mendegradasi RNA yang mengotori pada DNA yang akan
didapatkan. Tahap selanjutnya dengan menginkubasi kembali pada suhu 37ºC
selama 1 jam dan akan ditambahkan phenol-choloroform isoamil alcohol untuk
mengendapkan non DNA. Menurut Clark dan Beck (2010), Penggunaan PCI
digunakan untuk pemilihan pelarut organik pada metode deproteinasi. Kloroform
memiliki kemampuan dalam mendeproteinasi berdasarkan rantai polipeptida
dimana akan menyebabkan protein mengalami pengendapan.
Langkah berikutnya adalah disentrifugasi selama 10 menit dan dilakukan
penambahan choloroform equal volume, tahap ini akan dilakukan sebanyak dua
kali secara berturut-turut. Penambahan choloroform equal volume dilakukan agar
dapat mengendapkan sisa non DNA seperti protein, hal ini sesuai dengan Clark
dan Beck (2010), bahwa kloroform berguna dalam mepresipitasi protein. Hasil
dari sentrifugasi pada tahap akhir ini yaitu supernatant yang akan dipindahkan ke
tube baru dan akan ditambahkan isopropanol dan sodium asetat dengan tujuan
pengendapan DNA, seperti penyataan Syafaruddin et al (2011) bahwa, larutan
isopropanol bertujuan dalam mengumpulkan atau mengendapkan DNA. Menurut
Iqbal et al (2013), Larutan sodium asetat digunakan untuk membantu
mengendapkan DNA dalam metode lisis alkali. Langkah selanjutnya yaitu
diinkubasi pada suhu -20ºC selama 1 jam dan kemudian akan disentrifus selama
10 menit serta akan dilakukan proses pencucian dari pellet yang didapatkan
dengan etanol 70% untuk membersihkan debris yang tidak digunakan. Menurut
Sambrook dan David (2001), Tahap pencucian dilakukan dengan penambahan
etanol yang berfungsi untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak akan
digunakan seperti oligosakarida yang terikat pada asam nukleat. Langkah terakhir
yaitu pengeringan dengan vacuum dry yang digunakan untuk mengeringkan
pellet. Menurut Surzycki (2000), vacuum dry selain digunakan dalam pengeringan
pellet juga digunakan dalam menghilangkan residu etanol dengan cara evaporasi
karena etanol memiliki sifat mudah menguap. Pellet yang telah dikeringkan akan
dilarutkan dengan buffer TE 50 µl, isolasi DNA dapat dilihat melalui
spektrofotometer dan divisualisasikan pada alat UV transilluminator.

VI. Kesimpulan
Tahapan pada saat mengisolasi DNA tanaman diantaranya penghancuran sel,
penghilangan RNA dan protein serta pemurnian dan pengendapan DNA.
Praktikum kali ini dengan acara isolasi DNA pada sel tanaman dapat ditarik
kesimpulan bahwa dalam mengisolasi DNA sel tanaman menggunakan metode
mekanik dan kimiawi disebabkan sel tanaman yang dilindungi oleh dinding sel
yang kuat. Metode mekanik yang digunakan yaitu dengan cara penggerusan dan
penambahan nitrogen cair dalam membantu perusakan dinding sel tanaman.
Metode kimiawi yang digunakan dengan adanya penambahan buffer ekstraksi
yang bertujuan dalam menjaga pH dan struktur DNA serta tekanan osmosis sel.
Metode visualisasi yang digunakan menggunakan alat spektrofotometer dan UV
transilluminator.
 DAFTAR PUSTAKA

Amelia, Arie dkk. 2013. Motilitas dan Viabilitas Spermatozoa Itik Lokal (Anas
platyrhynchos) Setelah Penyimpanan Refrigerator dalam Ekstender
Dikombinasi Berbagai Konsentrasi Krioprotektan Gliserol. Jurnal Biologi,
(30) 1: 1-7.
Cappuccino, J. G. dan N. Sherman. 2002. Microbiology: A Laboratory Manual.
San Fransisco: Pearson Adecation Inc.

Clark, D. A. dan Beck, A. T. 2010. Cognitive Therapy Of Anxiety Disorders:

Science And Practice. New York: Guilford Press.

Das, S. dan Dash, H. R. 2015. Microbial Biotechnology A Laboratory Manual For

Bacterial System. India: Springer New Delhi.

Farmawati, A. D. et al. 2015. Perbandingan Kualitas DNA Dengan Menggunakan

Metode Boom Original Dan Boom Modifikasi Pada Isolat Mycobacterium
tuberculosis 151. Jurnal Kimia,(9) 1: 41-46.

Ferniah, S. dan Pujiyanto, S. 2013. Optimasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum

annuum L.) Berdasar Perbedaan Kualitas Dan Kuantitas Daun Serta Teknik
Penggerusan. Jurnal Bioma, (156) 1: 14-19.

Hadieoetomo, R. S. 1990. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium

Mikrobiologi. Jakarta: Gramedia.
Hariyadi, S. et al. 2018. Perbandingan Metode Lisis Jaringan Hewan dalam
Proses Isolasi DNA Genom pada Organ Liver Tikus Putih (Rattus
norvegicus). Proceeding Biology Education Conference, (15) 1: 689-692.

Iqbal, A. et al. 2013. An Efficient DNA Extraction Protocol For Medicinal Plants.
International Journal of Biosciences, (3) 7: 30-35.

Istianah, N. A. et al. 2018. Teknologi Bioproses. Malang: UB Press.

Lodhi, A. M. et al. 1994. A Simple and Efficient Method For DNA Extration
From Grapevine Cultivars, Vitis Spesies and Ampelopsis. Plant Molecular
Biology Reporter, (12): 6-13.
Sambrook, J. dan David W. R. 2001. Molecular Clonning: A Laboratory Manual.
3th ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Second

Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sulistyarsi, A. et al .2016. Pengaruh Konsentrasi dan Lama Inkubasi terhadap

Kadar Protein Crude Enzim Selulase dari Kapang Aspergillus niger.
Proceeding Biology Education Conference, (13) 1: 781-786.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques In Molecular Biology. Germany: Springer-

Verlag Berlin Heidelberg.

Switzer. 1999. Experimental Biochemistry. Oxford: Blackwell Scientific Pub.

Syafaruddin et al .2011. Efektivitas Dan Efisiensi Teknik Isolasi Dan Purifikasi

DNA Pada Jambu Mete. Buletin RISTRI, (2) 2: 151-160.