Analisis Simultan

Ibuprofen dan Pamabrom

dengan Metode HPLC
Kelompok 2a
• R. LUH AYU CISTHA STRIRATNA(2008611006)

• ADE ARI SUNDARI (2008611007)

• PUTU YUNITA (2008611008)

• PUTU WULAN PRAYASCITA (2008611009)

• NI KOMANG AYU TRI SUSANTI (2008611010)

 BAB 1

Pendahuluan
Latar Belakang

Dysmenorrhea
Nyeri kram pada perut bagian bawah saat
menstruasi yang dapat mengganggu aktivitas

Terapi Analgesik
Terapi dengan analgesik NASID (IBUPROFEN)
dengan kombinasi diuretik ringan (PAMABROM)

HPLC
Obat OTC
Perlu dilakukan Quality Control

Analisis secara Simultan

Pengembangan metod analisis untuk menganalisis kedua
senyawa secara SIMULTAN
Definisi Masalah
METODE STANDAR
Metode standar (USP dan FI) tidak mencantumkan
cara analisa ibuprofen dan pamabrom secara simultan

USP (2007) FI V (2014)

Kedua senyawa dianalisis dengan menggunakan HPLC fase terbalik,
yaitu dengan kolom packing L-1
Ibuprofen fase gerak :
air dan phosphoric acid pH 2,5 (1340 : 680)
Pamabrom fase ferak:
air: metanol: asam asetat glasial (69:30:1)
Hanya tersedia metode analisis untuk Ibuprofen
dengan HPLC fase terbalik menggunakan kolom
packing L-1 dan fase gerak 400 mL asam
kloroasetat 1g/mL pH 3 dengan 4 mL asetonitril
P

HPLC FASE TERBALIK

berpotensi dikembangkan menjadi metode analisis kedua senyawa tersebut secara simultan

OPTIMASI TERHADAP FASE GERAK

tujuan diperoleh suatu pengembangan metode yang valid untuk kedua senyawa tersebut

METODE SEBELUMNYA
Metode penetapa kadar terhadap ibuprofen dan pamabrom belum ada dilaporkan selain metode
yang tertera pada jurnal ini.
Target Analisis
AKURASI
akurasi dengan nilai r2 ≥ 0,98
akurasi dengan nilai % recovery 98 – 102%
METODE
PRESISI
VALID
presisi dengan nilai RSD < 2%

LOD DAN LOQ

dibawah nilai terendah yang dianalisis

NILAI TAILING FACTOR (tf)

nilai tailing factor (tf) yang menunjukkan bahwa kromatogram
MEMENUHI simetris yaitu dengan nilai tf = 1
PARAMETE WAKTU RETENSI
R DASAR harus singkat yaitu dipersyaratkan < 10 menit
HPLC
RESOLUSI PEMISAHAN
resolusi pemisahan yang dihasilkan yaitu < 1,5
Target Analisis

Analisis mampu
dilakukan secara
SIMULTAN

AKURASI
Λmax ibuprofen = 214 nm;
Λmax pamabrom = 280 nm

Dilakukan penentuan panjang gelombang optimal untuk

kedua senyawa
Pemilihan Metode

KELEBIHAN HPLC
 mampu memisahka molekul-molekul dari suatu campuran,
 mudah dalam pengoperasian instrumennya,
 kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi,
 dapat dihindari terjadinya dekomposisi atau kerusakan bahan yang
dianalisis,
 memiliki resolusi yang baik,
 detektor yang digunakan dapat bermacam-macam,
 kolom dapat digunakan kembali
 mudah dilakukan sample recovery
 BAB 2

Tinjauan Pustaka
Ibuprofen
Ibuprofen merupakan NSAID yang memiliki aktivitas
analgesik, anti-inflamasi dan antipiretik. Ibuprofen
berkerja dengan menghambat sintesis prostaglandin.
• Kelarutan : Sangat mudah larut dalam etanol, dalam
metanol, dalarn aseton dan dalarn kioroform; sukar
larut dalam etil asetat; praktis tidak larut dalam air.
• λMax: 273 nm (A11 = 18.5a)
• Recovery: Tablet Ibuprofen mengandung Ibuprofen,
C13H1802, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari Gambar 1. Struktur Ibuprofen
110,0% dan jumlah yang tertera pada etiket.
Pamabrom
Pamabrom adalah obat diuretik ringan yang
dikombinasikan dengan analgesik untuk menangani
dysmenorrhea.
Kelarutan :larut dalam air.
pKa :5,58.
Recovery :Pamabrom dalam basis anhidrat
dipersyaratkan memiliki kandungan tidak kurang dari
72,2 – 76,6% untuk kandungan 8-bromotheofilin,
sedangkan tidak kurang dari 24,6 – 26,6% untuk Gambar 2. Struktur Pamabrom
kandungan 2-amino-2-methyl-1-propanol
Eksipien
o Laktosa larut dalam air, praktis tidak larut dalam etanol
o Laktosa kemungkinan dapat ikut terekstraksi dalam proses ekstraksi yang dilakukan.
o Laktosa belum dilaporkan ada dilaporkan analisisnya menggunakan UV, penetapan kadar
laktosa dan identifikasinya menggunakan detektor IR tidak akan menganggu pada analisis
ibuprofen dan pamabrom dalam tablet.

o Kalsium fosfat tidak larut dalam air, namun larut dalam pelarut asam.
o Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut yang bersifat asam, yaitu dengan pH 3
o Kalsium fosfat kemungkinan dapat ikut terlarut dalam proses ekstraksi
o Kalsium fosfat identifikasinya menggunakan IR tidak akan mengganggu proses analisis yang
dilakukan.

o Avicel memiliki kelarutan praktis tidak larut dalam asam encer dan organik pelarut. Larut
sebagian dalam alkali encer dan air (fraksi natrium karboksimetilselulosa).
o Tidak larut dengan fase gerak yang digunakan untuk preparasi sampel
o Avicel tidak akan mengganggu analisis yang dilakukan.
High-performance liquid  Suhu operasi kolom yang digunakan adalah
chromatography (HPLC) 400C. Suhu kolom yang digunakan dapat
mencapai 200oC

 Fase gerak yang digunakan disesuaikan

dengan sifat dari analit yaitu pH dan kepolaran.

 Filtrasi dengan filter pori 0,45 µm untuk

mencegah partikel partikel besar yang dapat
menganggu atau menyumbat kolom yang
digunakan untuk analisis

 Laju alir yang digunakan dalam kondisi analisis

ini adalah 1 mL/menit

 Deteksi dilakukan dengan menggunakan

detektor UV pada panjang gelombang 245 nm
 BAB 3

Metode Penelitian
 Alat dan Bahan
ALAT BAHAN
• Instrtumen HPLC dengan • Standar Ibuprofen
kolom C18 ukuran 250 mm x • Standar Pamabrom
4,6 mm, ukuran partikel 5 µm • Matriks tablet (laktosa,
• Kertas filter ukuran pori 0,45 kalsium fosfat, avicel)
µm • Akuadest
• Beaker glass • Asam Kloroasetat
• Erlenmeyer • Amonium hidroksida
• Labu ukur • Asetonitril
• Pipet ukur • Internal standar (Valerofenon)
• Sonikator
• Corong kaca
• Batang pengaduk
• pH meter
• Timbangan analitik
 Kondisi Kromatografi
Disiapkan instrumen HPLC dengan kolom fase diam C18 ukuran 250 mm x 4,6 mm dengan ukuran partikel 5
µm

Diatur suhu operating kolom menjadi 40oC

Dibuat fase gerak dengan mencampurkan 4 gram asam kloroasetat dalam akuadest kemudian di-adjust
pHnya menjadi 3, dibuat larutan campuran dengan asetonitril hingga diperoleh perbandingan 4 : 6

Disaring fase gerak menggunakan filter membran ukuran 0,45 µm dan kemudian dilakukan degassing
dengan ultrasonikasi

Dibuat laju alir fase gerak menjadi 1 mL/menit

Panjang gelombang pada detektor diatur menjadi 254 nm dan diinjeksikan volume sampel sebanyak 10 µm

Elusi dilakukan dengan metode isokratik

 Penyiapan Larutan Standar
Dibuat larutan standar internal dengan melarutkan valerofenon pada 0,35 mg/mL

Dibuat standar ibuprofen dengan melarutkan 12,5; 25; 50 mg standar dalam 100, 50 dan 25 mL larutan
standar internal

Dibuat larutan standar pamabrom dengan melarutkan 6,3; 12,5; 25 mg standar dalam 100; 50 dan 25 mL
larutan standar internal

Setiap larutan divortex 1 menit, disonikasi 30 menit, kemudian disaring dengan membran filter 0,25 µm
 Kesesuaian Sistem dan Linieritas
Dilakukan analisis terhadap standar ibuprofen dan pamabrom dengan menggunakan RP-HPLC

Dilihat waktu retensi dan kromatogram yang dihasilkan untuk melihat adanya gangguan matriks
pada penetapan ibuprofen dan pamabrom

Dibuat larutan standar dengan varian konsentrasi dengan rentang 0,125 – 2 mg/mL untuk ibuprofen dan
0,05 – 1 mg/mL untuk pamabrom

Dianalisis larutan dengan menggunakan metode HPLC sehingga diperoleh nilai AUC dari masing-masing
varian konsentrasi

Dihitung regresi liniernya berdasarkan hubungan antara konsentrasi dengan AUC, ditentukan nilai r2

Linieritas dinyatakan valid apabila nilai r2 diperoleh ≤ 0,98 (ICH, 2009)

 Akurasi
Akurasi dibuat dengan menggunakan 3 varian konsentrasi yaitu 0,125; 0,5; 2 mg/mL untuk ibuprofen dan
0,053; 0,25; 1 mg/mL untuk pamabrom

Konsentrasi standar dihitung berdasarkan persamaan regresi yang diperoleh dari penetapan linieritas

Nilai akurasi dintentukan dari %recovery yang diperoleh, yang mana akurasi dinyatakan valid
apabila %recovery yang diperoleh adalah 98 – 102%
 Presisi
Presisi ditentukan dari pengulangan sebanyak 3 kali terhadap analisis standar yang digunakan untuk
menentukan akurasi

Presisi dilakukan keterulangan, presisi intraday dan interday

Presisi dinyatakan valid apabila %RSD < 2%

 Penetapan Kadar Sampel
Tiga larutan dengan konsentrasi yang telah ditetapkan disiapkan (sesuai dengan konsentrasi baku)

Dilakukan penetapan kadar terhadap sampel yang dianalisis dengan menggunakan metode RP-HPLC

Ditetapkan nilai %recovery, dipersyaratkan untuk ibuprofen sesuai dengan monografi yaitu 90 –
100%, untuk pamabrom sesuai dengan persyaratan akurasi 98-102%

Ditentukan nilai presisi, dengan persyaratan RSD < 2%.

 BAB 4

Hasil dan Pembahasan

Hasil dan Pembahasan
HPLC merupakan salah satu metode kromatografi untuk zat
cair yang disertai dengan tekanan tinggi
Metode HPLC digunakan untuk mendeteksi analit secara
serempak/simultan, memiliki kecepatan dan sensitifitas
tinggi meskipun jumlah sampel yang diinjeksikan sedikit,
mampu memisahkan molekul dari suatu campuran.
 Validasi metode
Kesesuaian Sistem Presisi Akurasi

LOD-LOQ Linieritas Kadar

1. Validasi Metode: Kesesuaian sistem

Dari gambar Kromatogram HPLC-UV (Ibu

Profen, Pamabrom dan Standar Internal)
menunjukkan hasil analisis pada waktu retensi
pamabrom di menit ke 2,6, ibuprofen di menit
ke 8 dan standar internal valerophenone di
menit ke 10,2. Kromatogram menujukkan 10.199
Standar
puncak-puncak yang baik tanpa adalnya Internal
gangguan atau matriks. 2.596 8.043 Ibu
Pamabr Profen
om

Penggunaa standar internal untuk memastikan

bahwa ibuprofen mampu menghasilkan hasil
yang sesuai, dikarenakan ibuprofen
memberikan nilai serapan yang rendah Gambar. Kromatogram HPLC-UV dari Ibu Profen, Pamabrom dan Standar Internal
meskipun pada panjang gelombang analisisnya
sesuai.
2. Validasi Metode: Lod dan Loq

LOD
LOQ
• Nilai LOD dari ibuprofen yang diperoleh adalah • Nilai LOQ dari ibuprofen yang diperoleh adalah
0,009 mg/mL 0,027 mg/mL

• Nilai LOD dari pamabrom yang dihasilkan • Nilai LOQ dari pamabrom yang dihasilkan adalah
adalah 0,002 mg/mL 0,006 mg/mL.

Analisis yang dilakukan telah valid, dikarenakan nilai terendah yang digunakan sebagai standar adalah
0,125 mg/mL untuk ibuprofen dan 0,05 mg/mL untuk pamabrom, yang mana kedua nilai tersebut
berada diatas nilai LOD dan LOQ untuk senyawa ibuprofen dan pamabrom.
3. Validasi Metode: Presisi
Tabel. Hasil Presisi Intraday dan Interday dari Pamabrom dan Ibuprofen
dengan Metode RP-HPLC

Sampel (mg/mL) RSD Intraday (%) RSD Interday (%)

Nilai presisi yang diperoleh pada table Ibuprofen
disamping menunjukkan nilai presisi
dibawah maksimum yang diperbolehkan, 0,125 0,2 1,1
yaitu dibawah 2%, baik untuk presisi 0,5 0,4 0,8
intraday maupun interday. Nilai ini berarti
2 0,3 1,3
bahwa metode telah mampu memberikan
hasil dengan keterulangan yang valid. Pamabrom
0,063 1,8 1,3
0,25 1,5 0,9
1 0,5 0,4
4. Validasi Metode: Linieritas
Ibuprofen Pamabrom

Data pada tabel menunjukkan bahwa nilai rata-rata r² ibuprofen dan pamabron secara
berturut-turut adalah 0,99953 dan 0,9994. Pada keadaan normal, linieritas diperoleh
ketika nilai r² ≥ 0,997 (Gandjar dan Rahman, 2012). Jadi linieritas metode HPLC untuk
ibuprofen dan pamabrom dinyatakan valid.
 5. Validasi Metode: Akurasi
Konsentrasi Intraday Interday Akurasi merupakan kedekatan antara nilai
(mg/mL)
Perolehan Akurasi (%) Perolehan Akurasi (%)
terukur dengan nilai yang diterima sebagai nilai
sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen
(mg/mL)
perolehan kembali (recovery) analit yang
ditambahkan. Akurasi yang dipersyaratkan untuk
Ibuprofen
analisis senyawa adalah sebesar 98%-102% dan
0,125 0,124 99,2 0,126 100,8 RSD tidak lebih dari 2% .

0,5 0,51 102 0,49 98 Data pada tabel menunjukkan bahwa nilai
2 1,98 99 2,05 102,5 akurasi ibuprofen dan pamabrom berada pada
rentang 98-102% dan nilai RSD kurang dari 2%.
Pamabrom Sehingga dapat dinyatakan bahwa metode HPLC
0,063 0,062 98,41 0,061 101,7
yang digunakan untuk menganalisis kedua
senyawa tersebut telah akurat dan valid karena
0,25 0,247 98,8 0,249 99,6 dapat menghasilkan nilai pengukuran kadar
analit yang dekat dengan nilai sebenarnya.
1 0,998 99,8 1,02 102
6. Validasi Kadar Sampel

Kadar sampel ditetapkan dari nilai %recovery, dipersyaratkan untuk ibuprofen sesuai
dengan monografi yaitu 90% – 110% dan pamabrom sesuai dengan persyaratan
akurasi, yaitu 98%-102% serta nilai presisi, dengan persyaratan RSD < 2%

Nilai %recorvery ibuprofen berada pada rentang 90%-110% dan pamabrom berada
pada rentang 98%-102%. RSD kedua sampel tersebut kurang dari 2%., sehingga
dapat dinyatakan bahwa metode HPLC yang digunakan untuk menganalisis kedua
sampel tersebut telah mampu menghasilkan nilai pengukuran kadar analit yang dekat
dengan nilai sebenarnya.
Kesimpulan
• Dari hasil penetapan kadar tablet kombinasi pamabrom dan ibuprofen
menggunakan metode RP-HPLC dengan kondisi yang dikembangkan pada
penelitian ini dapat dikatakan metode ini valid, karena telah memenuhi
persyaratan untuk kesesuaian sistem, linieritas, LOD, LOQ, akurasi dan presisi,
dengan nilai yang berada dalam rentang parameter yang sesuai untuk setiap
validasi.

• Penetapan kadar terhadap sampel tablet dilakukan dengan tujuan untuk analisis
ini, sehingga dapat diketahui bahwa metode yang digunakan adalah spiked
placebo. Hasil penetapan kadar sampel tablet memberikan hasil yang sesuai
untuk parmeter akurasi dan parameter presisi. Parameter akurasi yang
digunakan untuk sampel ibuprofen sesuai dengan monografinya (90 -110%),
namun untuk pamabrom digunakan sesuai dengan persyaratan akurasi untuk
sediaan farmasi, yaitu 98 -102%.
Saran
Pengembangan pada metode ini diharapkan dapat
dilakukan dari berbagai sampel tablet yang berbeda,
karena masing-masing formulasi memiliki komposisi
matriks yang berbeda, sehingga dapat diketahui
pengaruh dari berbagai matriks terhadap metode analisis
yang dikembangkan.
Daftar Pustaka

Depkes RI. 2014. Farmakope Indonesia. Edisi Kelima. Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
Moffat, A. C., M. D. Osselton and B. Widdop. 2011. Clarke’s Analysis of Drugs and
Poisons. Fourth Edition. London: Pharmaceutical Press.
Rowe, C. R., P. J. Sheskey, M. E. Quinn. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients.
London: Pharmaceutical Press.
USP. 2007. United Stated Pharmacophea 30-National Formultion 25. USA: United
Stated Pharmachopea.
Terima Kasih