A GENERIC APPROACH FOR THE

DETERMINATION OF TRACE
HYDRAZINE IN DRUG SUBSTANCES
USING IN SITU DERIVATIZATION-
HEADSPACE GC–MS
ANGGOTA KELOMPOK

▰ Kristina Megi Limba (2008611055)

▰ R. Ayu Indah Kusuma Maharani (2008611056)
▰ Ni Putu Yesi Anita Dewi (2008611057)
▰ Ni Luh Gede Wiwin Pebriani (2008611058)
▰ Tasya Pramiswari (2008611059)

2
1
BAB I
PENDAHULUAN

3
 LATAR BELAKANG

Impurity
Hidrazin Kromatografi
Hidrazin jumlahnya
Bersifat ion dengan
Digunakan sedikit Headspace
genotoksi elektrokimia,
dalam butuh GC-MS
dan berupa LOQ 100
produksi metode
impurity ppm
sensitif

4
 TARGET ANALISIS

Mengembangkan metode
Memperoleh metode
analisis yang dapat digunakan
analisis yang sensitif, 1 2 untuk mendeteksi hidrazine
cepat, dan handal
dalam berbagai obat.

Melakukan validasi metode untuk

memastikan bahwa metode yang
3 dikembangkan telah memenuhi
syarat-syarat validasi metode.

5
 DEFINISI MASALAH

1. Hydrazine merupakan pengotor dalam sediaan farmasi berpotensi sebagai

genetoksik. Dalam konsentrasi rendah genotoksik sudah mampu menimbulkan
bahaya bagi kesehatan. Dalam produk farmasi adanya pengotor berbahaya harus
dikendalikan sesuai dengan batas yang diperbolehkan atau harus dihilangkan
karena tidak memiliki efek terapeutik.
2. Analisis Hydrazine dalam suatu sediaan memungkinkan adanya gangguan dari
eksipien maupun obat atau zat aktif sehingga diperlukan metode yang lebih
selektif.
Untuk mendeteksi keberadaan Hydrazine dalam sediaan farmasi, diperlukan suatu
metode analisis yang sensitif, handal, dan cepat yaitu headscape GC-MS.

6
 DEFINISI MASALAH

4. Dalam memilih metode GC-MS dimana GC merupakan tempat

terjadinya pemisahan analit diperlukan perhatian khusus mengenai
pemilihan kolom kromatografi karena keberhasilan suatu pemisahan
analit terdapat pada pemilihan kolom kromatografi yang tepat.
5. Salah satu syarat menggunakan metode GC adalah sampel mudah
menguap, maka perlu dilakukan derivatisasi untuk meningkatkan
volatilitasnya.
6. Pengembangan metode analisis memerlukan validasi metode agar
diperoleh hasil yang memenuhi syarat validasi yang dipersyaratkan 4.

7
 TUJUAN

1. Mengembangkan metode Headscape GC-MS untuk penentuan

kadar hydrazin dalam sediaan farmasi
2. Melakukan validasi metode dalam analisis hydrazin dalam
sediaan farmasi dengan Headscape GC-MS
3. Melakukan penetapan kadar hydrazin dalam sediaan farmasi
dengan Headscape GC-MS

8
 Pemilihan Alternatif Metode

Gas Mass
Cromatography Spectrometry

Pemisahan terlebih dahulu

Selektivitas dan
sensitifitas yang tinggi
serta informasi data yang
tinggi
berdasarkan lamanya waktu
relatif yang dibutuhkan dan
selanjutnya dilakukan deteksi
GC-MS berat molekul dengan
spektrometri massa

Derivatisasi dan Headspace

GC-MS
9
2
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

10
 HIDRAZIN
• Cairan tidak berwarna, berasap, dan berminyak dengan bau amonia yang
tajam.
• Rumus molekul H4N2
• BM 32,0452 gram/mol.
• Larut dengan metil, etil, propil, dan alkohol isobutil; tidak larut dalam
kloroform dan dietil eter larut dengan air, etanol, dan aseton; tidak
bercampur dengan kloroform dan eter.
• Titik didih 113,5 °C.
• Log P (oktanol / air) −2.07 pada 25°C

11
 GC-MS
• GC-MS merupakan suatu metode yang
mengombinasikan dua metode analisis yang
berbeda yakni GC dan MS yang
dimanfaatkan untuk menganalisis senyawa
organik kompleks dan campuran biokimia
• Dasar pemisahan menggunakan GC adalah
penyebaran cuplikan pada fase diam
sedangkan gas sebagai fase gerak mengelusi
fase diam
• Spektrofotometer massa diperlukan untuk
mengidentifikasi senyawa sebagai penentu
bobot molekul dan penentuan rumus
molekul.
12
 HEADSPACE GC-MS

Ekstraksi yang dilakukan analit

didasarkan pada partisi zat yang sangat
mudah menguap. Semua komponen
yang tidak mudah menguap tetap
berada dalam vial headspace dan tidak
mengalami proses analisis. Hal ini
yang menyebabkan tidak adanya
keterlibatan matriks organik yang dapat
mengganggu

13
 DERIVATISASI

1. Senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis

dengan kromatografi gas terkait dengan volatilitas dan
Proses kimiawi
stabilitasnya.
untuk mengubah
2. Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk
suatu senyawa
kromatogram.
menjadi senyawa
3. Meningkatkan volatilitas
lain yang
4. Meningkatkan deteksi
mempunyai sifat-
5. Meningkatkan stabilitas
sifat yang sesuai
6. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor
tangkap elektron (ECD)

14
3
BAB III
METODE ANALISIS

15
 RANCANGAN METODE
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode Headspace GC-MS
untuk analisis hidrazin pada substansi obat. Headspace digunakan karena dapat
mengalisis sampel dimana hanya komponen volatile dalam wadah sampel yang
dapat ditransfer ke sistem GC, sementara komponen yang non-volatile akan tetap
berada pada botol injeksi. Analisis GC-MS yaitu penentuan bobot molekul fragmen-
fragmen yang terbentuk.

Penyiapan Pengondisian Validasi Analisis

Derivatisasi
Reagen Sistem Metode sampel

16
 ALAT DAN BAHAN

Alat: Bahan:
- Instrumen GC-MS - Asam Benzoat - Nitrogen
- Timbangan analitik - Purified water - Helium
- Aseton-d6 - EDTA
- Hidrazin monohidrat - Aseton
- N-metil-2-pirolidinone

17
 KONDISI GC-MS
Analisis dilakukan dengan menggunakan Agilent GC-MS yang terdiri dari 6890AGC,
5973NMassDetector, dan autosampler CTC Combi-Pal. Kondisi autosampler headspace yaitu suhu
oven inkubasi 100◦C, waktu inkubasi 10 menit, suhu headspace syringe 110 ◦C, kecepatan agitasi
500 rpm, waktu agitasi 18 detik, waktu pengadukan 2 detik, volume injeksi 500 µL, kecepatan
mengisi 100 µL/s, jarum pull-up delay 300 ms, kecepatan injeksi 1 mL/s, keterlambatan pra-injeksi
2 s, keterlambatan pasca injeksi 100 ms, dan syringe flush 5 menit dengan nitrogen. Agilent DB-624
(25m × 0.2mmi.d. × 1.12_m) kolom GC digunakan. Gradien suhu oven dimulai pada 100◦C selama
6 menit dan kemudian meningkat menjadi 220◦C dengan peningkatan 50◦C/menit dan ditahan
selama 2 menit pada 220◦C. A 4mm i.d. liner yang mengandung glass wool digunakan. Helium
digunakan sebagai gas pembawa dengan laju aliran konstan 1,2 mL/menit. Suhu injektor dijaga pada
200◦C dalam mode split (5:1). Detektor massa dioperasikan dalam mode dampak elektron (70 eV).
Suhu sumber dan suhu quad masing-masing diatur ke 230 dan 150◦C. Suhu saluran transfer MSD
diatur pada 230◦C. Produk derivatisasi hidrazin dipantau dalam mode selected ion monitoring (SIM)
dengan waktu tinggal 200 ms. Data hanya dikumpulkan antara 3,0 dan 6,0 menit. Untuk turunan
aseton, ion molekuler pada m/z 112 dipantau sementara untuk turunan aseton-d6, kedua ion pada
m/z 124 dan m/z 106

18
• Penyiapan Pereaksi Derivatisasi
Pereaksi derivatisasi dibuat dengan melarutkan 0,5 g asam
benzoat dan 0,5 mL aseton atau aseton-d6 dalam 10mL NMP.

• Penyiapan Standar
Larutan stok hidrazin disiapkan sekitar 1 mg/mL dalam
pengencer EDTA berair (0,1%).
1. Linieritas
Disiapkan larutan seri hidrazin dengan
konsentrasi 0,1 , 0,2 , 1 , 2, dan 10 ppm.

Dianalisis dengan GC/MS

Linieritas yang baik memiliki nilai koefisien

korelasi (r2) = 0,995

20
2. Presisi
Disiapkan 6 larutan uji dengan konsentrasi 1
ppm

Dianalisis dengan GC/MS

Presisi yang baik memiliki nilai RSD tidak

lebih dari 2%

21
 4. LOQ
3. Akurasi
Disiapkan larutan seri dengan rentang
Disiapkan larutan uji untuk konsentrasi 80-100%
akurasi

D Dianalisis dengan GC/MS

Dianalisis dengan GC/MS

LOQ adalah konsentrasi analit terendah

Akurasi yang baik berada pada yang dapat ditentukan dengan presisi
rentang (80-120%) dan akurasi yang dapat diterima.

22
 PREPARASI SAMPEL

Ditambahkan dengan 100

µL reagen derivatisasi
Ditimbang 10 mg sampel (0,5 g asam benzoate dan
dalam vial 10 mL 0,5 mL aseton atau
aseton d6 dalam 10 mL
NMP) dan 10 µL diluent.

Campuran
dihomogenkan, lalu
campuran dapat
digunakan untuk analisis
GC-MS 23
PENETAPAN KADAR

Diambil sampel dengan

syringe, lalu Dilakukan running
diinjeksikan sebanyak 1 sampel, dan ditunggu
µL pada injector hingga muncul spektrum
(injection port) dengan massa.
posisi tegak lurus

Dilakukan analisa data

spectrum MS

24
4
BAB IV
HASIL & PEMBAHASAN

25
 You can simply impress your audience
and add a unique zing and appeal to your
Presentations. Easy to change colors,
photos and Text. Get a modern
PowerPoint Presentation that is
beautifully designed. You can simply
impress your audience and add a unique
zing and appeal to your Presentations.
Easy to change colors, photos and Text.
Get a modern PowerPoint Presentation

Modern
that is beautifully designed.

Portfolio
Presenta-
tion
Linearitas dan sensitivitas metode dengan reagen derivatisasi
 You can simply impress your audience
and add a unique zing and appeal to your
Presentations. Easy to change colors,
photos and Text. Get a modern
PowerPoint Presentation that is
beautifully designed. You can simply
impress your audience and add a unique
zing and appeal to your Presentations.
Easy to change colors, photos and Text.
Get a modern PowerPoint Presentation

Modern
that is beautifully designed.

Portfolio
Presenta-
tion
Recovery hidrazin pada beragam API dengan reagen derivatisasi
 You can simply impress your audience
and add a unique zing and appeal to your
Presentations. Easy to change colors,
photos and Text. Get a modern
PowerPoint Presentation that is
beautifully designed. You can simply
impress your audience and add a unique
zing and appeal to your Presentations.
Easy to change colors, photos and Text.
Get a modern PowerPoint Presentation

Modern
that is beautifully designed.

Portfolio
Presenta-
Kromatogram pada sampel dimana (a) SB462XXX menunjukkan
tion
tidak adanya hidrazin dan (b) GSK211XXXB menunjukkan adanya
hidrazin dengan monitoring reagen derivatisasi
Derivatisasi Aseton Asetonazine Deteksi GC
hidrazin

Karena titik didih sedang maka

menggunakan metode headspace GC-MS

• Asetonazine menghasilkan ion utama pada m/z 56, m/z 97, dan m/z 112
• Aseton azine-d12 menghasilkan ion utama pada m/z 62, m/z 106, dan m/z 124
• Digunakan pelarut NMP karena pelarut ini sangat baik untuk melarutkan
sebagian besar API
• Konsentrasi aseton yang digunakan untuk derivatisasi perlu diperhatikan karena
dapat mempengaruhi tingkat presisi
Linieritas R2 ≥ 0,999

LOQ 0,1 ppm

Akurasi 79-117%

Presisi 2,7% dan 5,6%

 KESIMPULAN
• Metode Headspace GC-MS dengan derivatisasi sampel menggunakan aseton atau
aseton-d6 sebagai reagen derivatisasi telah dikembangkan untuk menganalisis senyawa
hidrazin pada beragam jenis obat. Reagen derivatisasi ini menyebabkan senyawa hidrazin
menjadi stabil dan memiliki volatilitas yang baik.
• Validasi metode yang dilakukan dalam analisis hidrazin yaitu LOQ 0,1 ppm baik
menggunakan aseton atau aseton-d6 sebagai reagen derivatisasi, r2=1,0000
menggunakan aseton dan r2=0,9998 menggunakan aseton-d6, presisi yang diperoleh saat
menggunakan aseton sebagai reagen derivatisasi yakni 2,7% dan 5,6% pada aseton-d6.
Akurasi yang diperoleh pada analisis memenuhi rentang akurasi yang dipersyaratkan
dengan nilai akurasi terendah yakni 79% yang diindikasikan terjadi akibat ikatan antara
hidrazin dengan API.
• Penetapan kadar hidrazin dengan menggunakan headspace GC-MS dan dilakukan
preparasi sampel dengan teknik derivatisasi dapat dilakukan sebagai analisis rutin
senyawa hidrazin.
 DAFTAR PUSTAKA

Agilent. 2001. Basic of LC/MS. USA: Agilent Technology.

Darmapatni, K.A.G., A.Basori, N.M.Suaniti. 2016. Pengembangan Metode GC-MS untuk Penetapan Kadar Acetaminophen pada
Spesimen Rambut Manusia. Jurnal Biosains Pascasarjana 18(3)
EMEA. 2006. Guideline on the Environmental Risk Assessment of Medicinal Products for Human Use. London: European Medicines
Agency
Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Analisis Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Hübschmann,Hans-Joachim. 2015. Handbook of GC-MS. Germany: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.
Hussain, S.Z. dan Kushnuma M. 2014. GC-MS: Principle, Technique and its Application in Food Science. International Current Science
13:116-126
IARC. 2015. IARC MONOGRAPHS – 115 : Hydrazine. Perancis: International Agency for Research on Cancer.
Johnson, L. E. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB.
NIST. 2018. NIST Chemistry WebBook, SRD 69 : Hydrazine. USA: U.S. Secretary of Commerce.
TERIMAKASIH

33