LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI FARMASI

PENETAPAN KADAR DNA

Jumat, 24 April 2020

KELAS C1 / 3

Nama : REZALIA ASIA PUTRI

NIM : 182210101058

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
A. TUJUAN
1. Mahasiswa mampu menentukan kadar DNA menggunakan spektrofotometri
2. Mahasiswa mampu menentukan kemurnian DNA hasil isolasi

B. TEORI UMUM

Kadar DNA dapat ditentukan dengan menggunakan spektrofotometri.

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada besarnya nilai
absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. DNA dan RNA mampu
menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260nm karena adanya basa purin dan
pirimidin. Kontaminan dari proses isolasi seperti protein dan fenol akan menyerap sinar
UV pada panjang gelombang 280nm sehingga kemurnian DNA/RNA dapat ditentukan
dengan menghitung nilai absorbansi 260nm dibagi nilai absorbansi 280nm. DNA yang
murni memiliki nilai antara 1,8 – 2,0.

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu
secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan
metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan
kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang
sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan
cara uji kualitatif. Uji kuantitatif DNA dengan metode spektrofometri ini bertujuan untuk
mengetahui keberadaan dan jumlah DNA di dalam suatu larutan.

DNA, RNA dan protein dapat diukur menggunakan Spektrofotometer, karena

DNA, RNA dan protein dapat mengabsorbsi sinar ultraviolet secara kuat pada rentang
panjang gelombang antara 260 hingga 280 nm. Hal itu mengindikasikan bahwa asam
nukleat dapat diukur secara kuantitatif dengan Spektrofotometer, begitu juga dengan
kontaminasi proteinnya. Dalam suatu sampel asam nukleat seringkali masih terdapat
protein yang sebenarnya tidak diinginkan. Dengan spektrofotometer, konsentrasi asam
nukleat dan protein masing-masing dapat diketahui secara kuantitatif, begitu juga dengan
tingkat kemurnian asam nukleat.

Secara umum, berikut ini adalah aturan penentuan konsentrasi asam nukleat yang
diukur dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm :
 a. Pengukuran Spektrofotometer yang menghasilkan Optical Density (OD)
sebesar 1 unit berarti mengandung DNA utas ganda dengan konsentrasi 50
mikrogram/ml.
b. Pengukuran Spektrofotometer yang menghasilkan Optical Density (OD)
sebesar 1 unit berarti mengandung DNA utas tunggal dengan konsentrasi 33
mikrogram/ml.
c. Pengukuran Spektrofotometer yang menghasilkan Optical Density (OD)
sebesar 1 unit berarti mengandung RNA utas tunggal dengan konsentrasi 40
mikrogram/ml.

C. ALAT DAN BAHAN

Alat :
a. Spektrofotometer
b. Kuvet kuarsa 1 ml
c. Mikropipet
d. Mikrotip

Bahan :
a. DNA genom dan DNA plasmid hasil isolasi
b. Buffer TE
c. ddH2O

D. PROSEDUR KERJA
Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotometri

Diukur blanko (kuvet diisi 1000µl aquabidest steril) pada panjang

gelombang 260nm sampai A = 0,00

Dipipet 5 µl DNA + 995 µl aquabidest steril kemudian campur dengan

baik.
 Diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 260nm

Diulangi pada panjang gelombang 280nm

Jumlah DNA ditentukan dengan asumsi 1 Abs260nm = 50 µg DNA

Menghitung konsentrasi DNA :

DNA µg / µl = A260nm x factor pengenceran x 50 µg/ µl

Menentukan kemurnian DNA = A260/ µl A280

Kemurnian tinggi bila pada A260 / A280 = 1,8 – 2,0

Catatan :

a. Apabila pada A260 / A280 nilainya < 1,8 maka kontaminan fenol/protein
b. Apabila pada A260 / A280 nilainya > 2,0 maka kontaminan RNA

E. SOAL LATIHAN
1. Mengapa DNA dapat ditentukan kadarnya menggunakan spektrofotometer?
Jawab :
DNA dapat ditentukan kadarnya dengan spektrofotometer karena DNA dan
RNA mampu menyerap sinar UV pada panjang gelombang 260nm karena adanya
basa purin dan pirimidin. Sebab alat spektrofotometer hanya dapat digunakan untuk
analisa senyawa yang mengandung gugus kromofor dan auksokrom seperti DNA
dan RNA pada basa purin dan pirimidinnya.
 2. Bagaimana cara mengetahui kemurnian DNA ?
Jawab :
Kemurnian DNA atau RNA dapat ditentukan dengan menghitung nilai
absorbansi λ 260nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280nm. Dan DNA yang
murni memiliki nilai antara 1,8 – 2,0. Itulah cara mengetahui kemurnian secara
kuantitatif dan kualitatif, maka kemurnian DNA dapat dicek dengan elektroforesis
gel untuk mengetahui tingkat kemurnian DNA dari kontaminan RNA.
3. Senyawa apakah yang biasanya mengkontaminasi DNA?
Jawab :
Senyawa yang biasanya mengkontaminasi DNA yaitu seperti protein, polifenol,
fenol RNA yang akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 280nm.

F. HASIL PENGAMATAN

HASIL PENGAMATAN

Hasil Pengamatan Penetapan Kadar dan Kemurnian DNA

Sampel A260 A280 Kadar DNA Kemurnian DNA
(µg/mL) (A260/A280)
1 0.423 0.226 4230 1.872

2 0.245 0.156 2450 1.571

3 0.371 0.153 3710 2.425

Rumus :

Kadar DNA (µg/mL) = A260 nm x faktor pengenceran x 50 µg/mL

Kemurnian DNA = A260/A280

Faktor pengenceran = 995 mL / 5 mL = 199 atau 200

Perhitungan :

1. Kadar = 0.423 x 200 x 50 µg/mL

= 4230 µg/mL

Kemurnian = 0.423 / 0.226

= 1.872

2. Kadar = 0.245 x 200 x 50 µg/mL

= 2450 µg/mL

Kemurnian = 0.245 / 0.156

= 1.571

3. Kadar = 0.371 x 200 x 50 µg/mL

= 3710 µg/Ml

Kemurnian = 0.371 / 0.153

= 2.425

Dari data diatas dapat disimpulkan bahwa sampel 1 masuk kedalam sampel
yang murni karena masuk dalam rentang (1.8 – 2.0) yakni bernilai 1.872. Sedangkan
sampel 2 termasuk kedalam sampel yang terkontaminan fenol / protein karena nilai
kemurnian < 1.8 yakni bernilai 1.571. Dan untuk sampel 3 termasuk kedalam sampel
yang terkontaminan RNA karena nilai kemurnian > 2.0 yakni bernilai 2.129.
G. PEMBAHASAN
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi
senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau
cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer
menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara
fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.
Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik,
baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari
alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor,
penguat arus dan indikator atau layar.
Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu
secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif
dengan metode spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk
menentukan kandungan / jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen
zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan
contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah satu teknik
analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau
komponen zat.

Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui
jumlah DNA, maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV
dengan panjang gelombang 260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan
kemurnian terhadap kontaminan protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi
suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio Abs260 /
Abs280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari
kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat
dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada Abs260 = 50 µg DNA utas ganda
tiap ml.

• Penetapan Kadar pada Panjang Gelombang 260nm dan 280nm

DNA, RNA dan protein dapat diukur menggunakan Spektrofotometer, karena

DNA, RNA dan protein dapat mengabsorbsi sinar ultraviolet secara kuat pada rentang
panjang gelombang antara 260 hingga 280 nm.
 Panjang gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA / RNA
menggunakan spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui
kandungan protein menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280
nm.
DNA mampu menyerap sinar UV pada λ = 260 nm karena adanya basa purin dan
pirimidin. Kontaminan dari proses isolasi = protein dan fenol (menyerap sinar UV pada
λ 280 nm), sehingga =

𝐴260
Kemurnian DNA =𝐴280

• Kelebihan & Kekurangan Penetapan Kadar dengan Spektrofotometri

➢ Kelebihan Spektrofotometer UV/VIS
a) Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
b) Caranya sederhana
c) Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

➢ Kekurangan Spektrofotometer UV/VIS

a) Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan
kebersihan dari kuvet
b) Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185
nm
c) Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi
dengan energy eksitasi rendah
d) Sinar yang dipakai harus monokromatis
• Syarat DNA Murni
Rasio Abs260 / Abs280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni
dan terbebas dari kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang
260 nm dapat dikonversikan menjadi konsentrasi, yaitu nilai 1 pada Abs260 = 50
µg DNA utas ganda tiap ml. jika hasil absorbansi < 1,8 maka DNA terkontaminan
oleh fenol/protein, namun jika hasil absorbansi >2,0 maka DNA terkontaminan oleh
RNA.
• Analisis Hasil Percobaan

Dari praktikum yang telah dilakukan, didapatkan perhitungan kemurnian DNA

pada sampel 1 A260 yaitu 0,423 dan A280 yaitu 0.226, sehingga kemurniannya tinggi
karena termasuk dalam syarat rentang DNA murni yaitu antara 1,8 – 2,0 yakni bernilai
1.872. Sedangkan sampel 2 termasuk kedalam sampel yang terkontaminan fenol /
protein karena nilai kemurnian < 1.8 yakni bernilai 1.571. Dan untuk sampel 3 termasuk
kedalam sampel yang terkontaminan RNA karena nilai kemurnian > 2.0 yakni bernilai
2.129.

• Titik Kritis
Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis menggunakan
spektrofotometer adalah:
a. Serapan oleh pelarut
Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi
matrik selain komponen yang akan dianalisis.
b. Serapan oleh kuvet
Kuvet yang biasa digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa. Dibandingkan
dengan kuvet dari bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan kualitas yang lebih
baik, namun tentu saja harganya jauh lebih mahal. Serapan oleh kuvet ini diatasi
dengan penggunaan jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang sama untuk tempat
blangko dan sampel.
c. Kesalahan fotometrik normal
Pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini
dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas
dari alat yang digunakan. (melalui pengenceran atau pemekatan) Sama seperti
pH meter, untuk mengatasi kesalahan pada pemakaian spektrofotometer UV-
VIS maka perlu dilakukan kalibrasi.
H. KESIMPULAN & SARAN
Kesimpulan
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa
berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat
ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer.

Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa sampel 1 masuk kedalam

sampel yang murni karena masuk dalam rentang (1.8 – 2.0) yakni bernilai 1.872.
Sedangkan sampel 2 termasuk kedalam sampel yang terkontaminan fenol / protein
karena nilai kemurnian < 1.8 yakni bernilai 1.571. Dan untuk sampel 3 termasuk
kedalam sampel yang terkontaminan RNA karena nilai kemurnian > 2.0 yakni bernilai
2.129.

Saran

Sebaiknya praktikan lebih teliti lagi dalam melakukan praktikum dengan cara
mengikuti tahapan yang telah ada, agar didapat hasil yang maksimal dan sesuai dengan
teori yang telah ada sehingga dapat meminimalisir kesalahan.
 DAFTAR PUSTAKA

• Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of
microorganisms. Prentice Hall.
• Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica.
• Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. Washington: ASM Press
• Muladno, 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda