ELEKTROFORESIS

1. DNA Gel Agarose

Fusvita M, S.ST, MM, M.Si

SEJARAH ELEKTROFORESIS

Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler telah dimulai pada akhir abad ke 19,
setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai
kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-
sistematik) dari hewan ataupun tumbuhan. Elektroforesis berasal dari bahasa
Junani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel
listrik. Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah
ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-
partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik.
 DEFINISI ELEKTROFORESIS

Menurut Titrawani 1996

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang

didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi
oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia
dari molekul.
Menurut Ricardson dkk 1986
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran
berat molekul dan muatan listrik yang dikandung
oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik
dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah
berisi protein plasma maka komponen-komponen
protein tersebut akan mulai bermigrasi
 DEFINISI ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media bermuatan
listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk molekul yang
terlibat
Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui media (biasanya gel), molekul yang kecil
akan bermigrasi lebih cepat daripada yang besar sehingga akan terjadi pemisahan
 Elektroforesis DNA

Pemisahan DNA didasarkan pada :

Ukuran (berat
molekul/Panjang Muatan listrik
fragmen) Multan listrik DNA dapat
Ketika DNA bergerak menyebabkan DNA
melewati gel, ukuran tersebut bias bergerak
yang lebih kecil akan dalam gel. DNA memiliki
berpindah lebih cepat muatan listrik negative
dibandingkan dengan karena memiliki gugus
ukuran yang lebih besar. fosfat bermuatan negatif.
Elektroforesis Horizontal untuk
Analisis DNA

Perangkat elektroforesis terdiri dari: power supply, mesin

elektroforesis, cetakan gel dan
sisir.
Alat dan Bahan

• Comb atau sisir digunakan untuk

membentuk well pada gel agarosa
• Tray digunakan sebagai cetakan gel agarosa
• Chamber digunakan sebagai wadah gel
agarosa
• Sumber listrik digunakan untuk memberia
arus pada saat proses elektroforesis
• Agarose
• Marka
• Loading dye merupakan senyawa yang
memiliki massa jenis yang tinggi, sebagai
pemberat untuk DNA sehingga DNA bisa
tenggelam di dalam sumur
• Buffer Elektroforesis
• Pewarna DNA
 • Agarosa merupakan polimer dari 3,6-AnhidroL-galaktosa dengan

Agarose b-d-galaktosa, yang memiliki komponen netral atau tidak

bermuatan
• Gel ini mengandung larutan buffer Tris Asetat EDTA (TAE) yang
dapat memberikan resolusi untuk DNA

• Persentase agarose yang digunakan tergantung dari ukuran

fragmen yang akan diperiksa. Konsentrasi gel agarose dilihat
dari persentase agarose terhadap volume bufer (w/v),
normalnya konsentrasi gel agarose berada pada range 0,2% -
3%. Gel agarose biasa digunakan untuk memisahkan molekul
DNA yang berukuran ~100 bp hingga ~20 kbp di dalam
medan magnet secara tidak langsung. Semakin rendah
konsentrasi gel agarose, maka semakin cepat migrasi fragmen
DNA. Jadi, jika tujuan kita adalah untuk memisahkan fragmen
DNA berukuran besar, maka perlu dibuat gel agarose dengan
konsentrasi rendah. Sebaliknya, jika fragmen DNA yang hendak
dipisahkan berukuran kecil, maka perlu dibuat gel agarose dengan
konsentrasi tinggi.
 Buffer

– Buffer dalam elektroforesis gel digunakan untuk

menyediakan ion yang membawa arus dan untuk
mempertahankan pH pada nilai yang relatif konstan.
Buffer ini memiliki banyak ion didalamnya, yang
diperlukan untuk mengalirkan listrik.
– beberapa buffer yang umum digunakan adalah asam
nukleat Tris / Acetate / EDTA (TAE), Tris / Borate /
EDTA (TBE)

– Tris / Acetate / EDTA (TAE)  dibuat dari 20 mM Tris

Acetate dengan 1 mM EDTA ph 8,0

9
Marka DNA

Marka merupakan segmen DNA yang telah

diketahui ukurannya. Marka berfungsi untuk
mengetahui ukuran DNA hasil amplifikasi.
a. 100 bp
b. 1 kbp
 Pewarna DNA
– Pewarnaan Etidium
bromide (EtBr) – EtBr mampu berinteraksi diantara pasang
basa nukleotida pada struktur double heliks
dan saat gel hasil elektroforesis disinari
dengan UV maka fragmen DNA yang telah – SYBR Green, GelRed,
terpisah tampak sebagai band berwarna Methylene Blue, Cresyl
jingga Blue yang Brilian, Nile
– Penting untuk dicatat bahwa Etidium Blue Sulphate, dan
Bromida bersifat mutagenik dan toksik, Crystal Violet.
sehingga senyawa ini harus diperlakukan Lebih aman dari EtBr
dengan sangat hati-hati.
– EtBr dapat ditambahkan pada gel atau
dilarutkan pada buffer dan gel direndam
padanya sesudah elektroforesis
 UV Transiluminator

Gel documentation (Geldoc) dengan UV

Transiluminator dipergunakan untuk
membantu mendeteksi pita-pita DNA hasil separasi
(running) elektroforesis, sehingga pita
DNA yang teramati dengan sinar UV dapat
langsung direkam melalui koneksi langsung
dengan komputer.
Faktor yang Mempengaruhi
Kecepatan Migrasi Suatu Molekul
1. Arus listrik, semakin besar arus listrik yang digunakan maka laju migrasi akan
semakin cepat;
2. ukuran molekul, semakin kecil ukuran suatu molekul maka laju migrasinya akan
semakin cepat; bentuk molekul, molekul yang memiliki rasio axial tinggi memiliki
laju migrasi yang lebih lama daripada molekul berbentuk spherical; konsentrasi
gel, semakin rendah
3. konsentrasi gel maka laju migrasi semakin cepat karena gesekan molekulnya
berkurang;
4. adanya pewarna Etidium Bromida di dalam gel dapat menyebabkan pengurangan
kecepatan laju migrasi; dan
5. komposisi larutan buffer, larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan
panas sehingga aliran listrik dan laju migrasi molekul pun meningkat.
 Pembuatan gel agarose
1. Tentukan konsentrasi atau presentase agarose
yang dibutuhkan Misalnya telah ditentukan akan
dibuat 2% gel agarose dalam volume 40 ml 1x
buffer TAE, maka jumlah agarose yang akan
ditimbang yaitu:
2 gram/100ml x 40ml= 0.8 gram.
1. Tempatkan 0.8 gram agarose ke dalam labu erlenmeyer
dan isi dengan larutan 1X Buffer TAE sampai volume
40ml, kemudian kocok sampai merata.
2. Panaskan dalam microwave sampai mendidih sampai
larutan menjadi jernih.
1. Didinginkan agarose kira-kira sampai 600C dan
tambahkan
2. Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan
pasang combs, tunggu kurang lebih 30 menit atau
sampai gel mengeras. Lepaskan combs secara perlahan-
lahan dan gel agarose siap digunakan untuk
elektroforesis
1
4
 Mekanisme Pemisahan DNA

Cara Kerjanya :
a) Gel dihubungkan dengan sumber listrik

b) Gel diletakkan dalam buffer

c) DNA dimasukkan ke dalam sumur yang ada diujung gel yang bermuatan
negatif/Katoda.

d) Aliran listrik akan mengalir melalui gel

-DNA bergerak menuju gel yang bermuatan positif (+) dari yang bermuatan
negative (-) atau sering disebut “runs to the red
 PEMBUATAN GEL AGAROSA
Pembuatan gel agarose dengan
mencampur dan memanaskan Menunggu ±30 menit
Larutan Agarose
bubuk agarosa + buffer TAE (Tris- hingga gel mengeras, Meletakkan tray
dituang kedalam
accetate-EDTA) setelah dingin kemudian sisir dilepas kedalam tank
tray yang telah
ditambahkan ethidium Bromide perlahan. Akan tampak elektroforesis
dipasang sisir.
(EtBr) (pewarna pita DNA) lubang sumuran (well)

Setelah proses Menutup tank

Meletakkan gel pada
elektroforesis selesai, elektroforesis dan sampel DNA
UV-transilluminator
arus listrik dimatikan menghubungkan dan Marka
dan melihat pita DNA
dan mengambil tray arus listrik. Proses dimasukkan ke
yang kelihatan terang
dengan sarung tangan elektroforesis siap dalam sumur.
(Magdeldin,2012)
(glove) dijalankan
PEMBUATAN GEL AGAROSA
Elektroforegram

Karakterisasi hasil isolasi gen pengkode Nattokinase hasil PCR

dilakukan berdasarkan analisi migrasi menggunakan
elektroforesis gel agarosa 1 % pada 80 V dan 400 mA selama 60
menit. Selanjutnya gel direndam dalam larutan EtBr untuk
divisualisasi menggunakan lampu UV
terlihat bahwa pita berada diantara marka 1000 pb dan 1500
pb sesuai dengan ukuran teoritisnya yang berada pada nilai
1086 pb. Intensitas pita gen pengkode Nattokinase hasil
ekstraksi gel sekitar sama dari intensitas pita marker 1000 pb
atau sebanding dengan konsentrasi DNA 60 ng/µL. Konsentrasi
gen pengkode Nattokinase sekitar 60 ng untuk 5 µL total yang
diloading atau 12ng/µL.
Contoh Hasil Elektroforegram

Penyakit toxoplasmosis dapat didiagnosis

menggunakan metode molekuler.
Keberadaan gen B1 (ukuran 500 bp) dari T. gondii
dalam darah seseorang dapat dideteksi
menggunakan PCR.
Contoh Hasil Elektroforegram

Corona Virus Desease

MANFAAT ELEKTROFORESIS
GEL
Mengetahui
ukuran fragmen
DNA dari produk
PCR

Memisahkan produk
DNA dari hasil digesti
yang berbeda
ukuran, kemudian di-
sequencing

Pemurnian atau
purifikasi DNA
Check this video

https://www.youtube.com/watch?v=wXiiTW3pflM&t=44s

https://www.youtube.com/watch?v=KKmiKKMDDhY&pbjreload=101

https://www.bio-rad.com/webroot/web/html/lse/support/tutorial-agarose-gel-
electrophoresis-wndw.html
TERIMAKASIH

ANY
QUESTION?