Oleh
M. Iqbal Arif
P2BA09009
2010
DAFTAR ISI
Halaman
LANDASAN TEORI
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada
umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi
sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk
TUJUAN
3. Ampisilin
6. Tabung mikrosentrifuga
7. Sarung tangan
9. Lemari pendingin
10. Kamera Digital
CARA KERJA
DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).
diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37 oC
2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
menit.
3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x
g selama 5 menit.
5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik
7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga
9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang
dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000
11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000
12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column
ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000
13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk
14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah
dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm
15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah
dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi
Hasil Isolasi Plasmid dalam visualisasi yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Keterangan:
6 = A1 (pUC + E Cor I)
Migrasi pita pita di elektroforesis
Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) biasanya sering kita sebut miniprep yang
singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Mini-prep maupun medi-
prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang beda.
Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale
isolation of plasmid.
Kendaraan merupakan salah satu alat untuk memindahkan sesuatu dari satu tempat ke
tempat lain. Dalam bioteknologi rekayasa genetika yang telah melanda dunia saat ini, kendaraan
juga diperlukan dan merupakan kebutuhan mutlak. Kendaraan yang digunakan dalam
bioteknologi ini berfungsi sebagai alat untuk memindahkan gen (sepotong molekul DNA) dari
satu organisme ke organisme hidup lain. Dalam bioteknologi, kendaraan tersebut dikenal dengan
nama vector. Adapun gen yang bisa dipindahkan dapat berasal dari molekul DNA manusia,
hewan, tumbuhan dan semua organisme hidup lainnya. Oleh karena jenis kendaraan ini berasal
dari sel organisme hidup, kita sebut saja kendaraan ini sebagai biotransport.
Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom berupa DNA sirkular. Namun,
disamping memiliki kromosom tersebut, bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang
ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Materi ini disebut dengan plasmid
yang merupakan DNA bakteri yang terpisah dari DNA kromosomnya. Plasmid merupakan satu
dari beberapa jenis biotransport yang paling populer digunakan dalam bioteknologi rekayasa
genetika. Beberapa karakteristik dari plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak
berujung), berukuran kecil, terdapat dalam sitoplasma namun di luar kromosom (ekstra
kromosom) dan dapat melakukan replikasi secara autonom, secara genetik dapat ditransfer
dengan stabil, mengandung berbagai jenis gen. Jenis, jumlah jenis dan jumlah tiap jenis (copy)
plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid terdapat di
dalam sitoplasma organisme prokariot dan eukariot sederhana uniseluler. Selain dalam bakteri,
plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Pada kelompok prokariot, plasmid
diketahui memiliki ukuran yang sangat bervariasi antara kurang dari 1 juta Dalton sampai 200
juta Dalton. Sifat fenotipe dari plasmid biasanya telah teridentifikasi, misalnya tahan terhadap
antibiotik, memproduksi antibiotik, degradasi aroma, tahan terhadap logam berat, fermentasi
gula dan lain-lain. Namun, ada pula plasmid yang belum teridentifikasi sifat fenotipe-nya dan
Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk
kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau
transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen tidak lama setelah
David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu
pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing.
Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang
pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah
menunjukkan identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor
adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen penanda
resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang
membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki MCS (Multiple Cloning Site)
pada gen lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan
seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid
juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya (contoh: pAP01 (amyH), berarti
Untuk mengisolasi DNA plasmid dari keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri,
biasanya digunakan metode lisis alkali atau sentrifugasi dalam gradien CsCl. Kedua metode ini
akan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode
lisis alkali, sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi
ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan DNA
kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya dengan sentrifugasi keduanya
dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan plasmid dengan kemurnian yang tinggi.
Berdasarkan metode lisis alkali, sekarang ini telah banyak dikembangkan suatu kit untuk
isolasi plasmid. Dibandingkan dengan metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan
kit, pekerjaan menjadi lebih cepat dan mudah. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi,
biasanya kit semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin
column yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan saat
pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan suatu larutan yang
dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut (proses elusi).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang
terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada
umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi
sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa
genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang
diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua
organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal
(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel,
organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling
lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang
paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA
Anonim, 2009, Isolation of plasmid DNA (pGEX-4T-3) from E. coli XL1-Blue culture using the
QuickPickTM Plasmid DNA kit, www.bnpands.com / www.bionobile.com
Xiuhua Chen, 2003, Isolation of Plasmid DNA Rescued From Single Colonies of Agrobacterium
tumefaciens by Means of Rolling Circle Amplification, International
Society for Plant Molecular Biology
ACARA II.
LANDASAN TEORI
Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai
pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu
organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA
rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat
diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah
pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan
Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand
DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi
dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong
TUJUAN
1. Plasmid pUC19
4. Tabung mikrosentrifuga
5. Sarung tangan
6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
8. termometer
CARA KERJA
1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom,
2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat
terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam
tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI
hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan
komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan
5. tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C
menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Keterangan:
6 = A1 (pUC + E Cor I)
Dari hasil praktikum dapat dilihat bahwa plasmid yang disediakan berhasil dipotong oleh
beberapa enzim retriksi. DNA plasmid yang merupakan DNA sirkuler telah berhasil dipotong
menjadi DNA linier yang pada hasil berupa visual sampel larutan DNA plasmid yang diperoleh
menggunakan elektroforesis gel agarosa terlihat seperti 2 pita pada masing masing sumuran.
Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa
DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs
individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam
fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim
endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu
dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik. Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi
molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi
tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim
EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama
(I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′. Jika molekul
DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang
mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA
dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda .Jadi
sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat
Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus
aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini
memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di
sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang
mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Enzim
restriksi tidak hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur
hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung
tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket.
.
DAFTAR REFERENSI
Kristamtini, 2003, Kontruksi Vektor Pemotong S. Cereviceae dengan Gen Penanda hisg-URA 3-
HISG, Jurnal Bioteknologi Pertanian Vol 8 no 1
http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045
ACARA III.
LANDASAN TEORI
atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain
agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di
bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan
larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam
terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup
memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi
elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan
untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran
2. Agarosa
3. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH
4. Akuades
6. Labu Erlenmeyer 50 ml
7. Tabung mikrosentrifuga
8. Sarung tangan
12. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;
14. UV transluminator
15. Kaca mata UV
CARA KERJA
asisten)
2. Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20
mL
jernih.
pencetak gel.
7. Setelah gel memadat, pindahkankan gel
tangki elektroforesis.
Sebelum dipindahkan ke
terlebih dahulu
8. Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah
bagian bawah.
menggunakan kamera .
HASIL DAN PEMBAHASAAN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Keterangan:
6 = A1 (pUC + E Cory I)
Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses
elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan
meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis didasarkan pada
perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara keduanya. Karena
elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik
maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda bermuatan positif (kutub positif)
marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak
jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat.
Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran
sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan
kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena
adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi
pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka
bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang
sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan
DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga
diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi,
kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak
dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena
goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran menunjukkan
adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan
ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya
smear.
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat
dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih
besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut)
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda
positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk
menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam
nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium
dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel
yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam
sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar
ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses
pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang
berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang
bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang
merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan
ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel
yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita
sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/
ACARA IV
LANDASAN TEORI
bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah
karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA
tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.
2. media LB cair
5. es batu
6. shaker-incubator
7. termometer
8. Tabung mikrosentrifuga
11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)
15. Erlenmeyer
CARA KERJA
cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi
dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25
ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume
kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.
3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam
selama 5 menit.
selama 5 menit.
CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini
terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan
sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid
cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi
10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang
nomor 5).
11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit
dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera
dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu
37oC.
X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu
Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan
16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media
17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan
Dimana,
Sel Kompeten (Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel (bakteri atau yeast)
membran sel dari bakteri atau yeast tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA,
sehingga DNA yang telah masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring
pembelahan sel mikroba tersebut. Larutan yang digunakan untuk mengubah struktur
tingkat permeabilitas membran tersebut adalah larutan garam, seperti CaCl2, MgCl2,
dan LiCL2.
transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut
transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid
masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka
Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat
kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga
nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid,
sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid.
pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada
sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat
tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman
saja.
secara jelas. Penambahan etanol pada pembuatan sel kompeten menurunkan efisiensi
dinding sel. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa adsorpsi DNA didukung oleh LPS
dinding sel bakteri. Mekanisme yang diajukan adalah pengikatan DNA pada molekul
LPS sel kompeten dilanjutkan dengan pemasukan DNA ke sitosol karena adanya
disintegrasi membran sel akibat CaCl2 . CaCl2 mempengaruhi dinding sel dan
mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama
Kultur sel E.coli yang telah mengalami perlakuan MgCl2 dan CaCl2
dalam percobaan ini menjadi sel yang kompeten. Fragmen DNA asing yang
diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap ampisilin yang
berperan sebagai marka seleksi. Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid
yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69
kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada
gambar .
Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti
berikut:
Kultur sel E.coli yang telah mengalami perlakuan MgCl2 dan CaCl2 dalam
percobaan ini menjadi sel yang kompeten. Fragmen DNA asing yang
diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap ampisilin yang
berperan sebagai marka seleksi Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut
panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan
perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri
seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi.
ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang
bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni
pUC 19 (gambar 1) yang mengandung gen resisten ampisilin mampu tumbuh pada
media LB yang ditambahkan ampisilin dan membentuk 16 koloni. Hal ini harusnya
tidak terjadi, karena E.coli yang ditumbuhkan pada media tersebut tidak resisten
karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis
atau kurang steril. E.coli yang ditransformasi pUC 19 yang mengandung gen resisten
ampisilin mampu tumbuh pada media LB yang ditambahkan amphisilin (gambar 2),
setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 416 koloni, hal ini dikarenakan bahwa
E.coli tersebut mengandung gen resisten ampisilin yang di transformasi dari pUC 19
yang mengandung gen resisten ampisilin. Sedangkan E.coli yang ditumbuhkan pada
media tanpa ampisilin, baik pada E.coli transforman (gambar 3) maupun non
tidak ada ampisilin sehingga E.coli mampu tumbuh dengan baik. Pada cawan sampel
tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri
ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju
transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media
seleksi.
adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel
yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni
bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni
http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-
metode-cacl2/http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi
%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf
@ 3 ml
Inkubasi 370C,
E.coli 25 ml shaker 150
transforman LB rpm, 16 jam
pUC19 1 Sentrifugasi
Sp 5.700xg (5000 rpm), 5'
Cairan
dibuang dibuang
Kolom
pindah + 1 ml STE
resuspensi
Sentrifugasi
+ 500 µl Buffer PB Sp
5000 rpm, 5'
dibuang
Sentrifugasi
+ 50 µl Buffer EB 13.000 rpm, 1'
Cairan + 250 µl Buffer P1
Sentrifugasi dibuang Resuspensi (vortex, bolak balik
13.000 rpm, 1'
+ 250 µl Buffer P2
Bolak-balik sebentar
+ 750 µl Buffer PE
Warna
Sentrifugasi mjd BIRU
13.000 rpm, 5'
Cairan + 350 µl Buffer N3
DNA Bolak-balik sebentar
dibuang
plasmid
Warna
BIRU
hilang
Sentrifugasi Sentrifugasi
13.000 rpm, 1' 13.000 rpm, 1'
Sp
dipindah
Sentrifugasi
13.000 rpm, 1'
Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid
No. Komponen P1 P2 P3
1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl
2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl
3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl
4. DNA
pUC19 20 µl 20 µl 20 µl
5. PstI 2 µl - -
6. HinfI - 2 µl -
7. HindIII - - 2 µl
Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl
Keterangan :
P1= volume enzim restriksi sebanyak 0,5 µ
P2= volume enzim restriksi sebanyak 1 µl
P3= volume enzim restriksi sebanyak 1,5 µl
P4= volume enzim restriksi sebanyak 2µl
P5= volume enzim restriksi sebanyak 2,5 µl
1 2 3 4 5 6 7
P1 P2 P3
Spin sebentar,
2”
Ketuk-ketuk
Simpan di
frezer Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit
Lampiran 4.Skema Keja Pembuatan Gel Agorosa Elektroforesis
Gel agarosa
Dihomogenkan dengan
pemanasan hingga mendidih
Sampel DNA
Sp
E. coli JM 09 Sel kompeten, gliserol
Medium LB
Inkubasi ± 16 jam
Overnight
37 0C
Inkubasi ± 16 jam
Overnight
Shaker incubator
Medium LB 150 rpm
LB 25 ml 37 0C
Overnight
E.coli JM 09 Diambil 250 µl
Inkubasi ± 2 jam
Shaker incubator 150 rpm
37 0C
LB cair 25
Masing-masing ml
1,5 µl
Sentrifugasi
5.000 rpm Tabung
5 menit sentrifuga
1 2 3 4 5 6
Dibuang supernatannya
+ 500 CaCl2 (Vortex)
Sentrifugasi 5.000 rpm, 5 Kerja
menit Aseptis
Dibuang supernatannya
+ 200 CaCl2 (Vortex)
Inkubasi :
Tabung 1 dan 2 selama 2 jam Transformasi
Tabung 3, 4 dan5 selama 16 jam
Lampiran 7. Skema Kerja Transformasi E. coli JM 109
Inkubasi 2 jam
Tabung sentrifuga berisi
E.coli JM 09 kompeten
inkubasi 2 jam
1 2
Simpan di ES
2
Tabung sentrifuga
treatment 1 2
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk
pUC 19 10 µl -
100 µl 50 µl
1A 1B
1 2
PLATING 1
Medium LB Amp Medium LB
inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit
2A 100 µl 50 µl 2B
3 5 Simpan di ES
4
Tabung sentrifuga
treatment 3 4 5
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk pUC 19 10µl - -
pUC 19 rekombinan - 2 µl -
100 µl 50 µl
5B
koloni pengenceran CFU
5A pUC19 g
5
Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)
medium Medium LB
LB Amp [pUC 19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)
Inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit
Dihitung jumlah koloni putih pada cawan 4A untuk diketahui effisiensi transformasinya
Lampiran 8. Media Pertumbuhan Bakteri
- IPTG 1,2 g
Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian
simpan pada 4o C.
- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg
Larutkan dalam 2 ml N,N'-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil
kemudian simpan dalam -20o C.