Anda di halaman 1dari 49

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL MOLEKULER

Oleh

M. Iqbal Arif
P2BA09009

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN


FAKULTAS BIOLOGI
PROGRAM MAGISTER BIOLOGI
PURWOKERTO

2010
DAFTAR ISI

Halaman

ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID

ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

ACARA IV. PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI


ACARA I.

ISOLASI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang

terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada

umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi

sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa

genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang

diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk

komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19

2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

3. Ampisilin

4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

6. Tabung mikrosentrifuga

7. Sarung tangan

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Lemari pendingin
10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan

diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC

selama 16 jam (semalam).

2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung

mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5

menit.

3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x

g selama 5 menit.

4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.

5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik

sebanyak 4-6 kali.

6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.

7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga

warna suspensi kembali seperti warna awal.

8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm

(17,900 x g) selama 10 menit.

9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang

dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000

rpm (17,900 x g) selama satu menit.


10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke

dalam tabung mikrosentrifuga.

11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000

rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column

ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000

rpm selama satu menit.

13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk

menghilangkan sisa buffer pencuci.

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah

dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm

selama satu menit (elusi pertama).

15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah

dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi

pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).


HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Isolasi Plasmid dalam visualisasi yang diperoleh menggunakan elektroforesis gel agarosa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III) 7 = A2 (pUC + Pst I)

2 = K1 (pUC + HindIII) 8 = A3 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I) 9 = A4 (pUC)

4 = K3 (pUC + Pst I) 10 = K1 (pUC hasil isolasi)

5 = K4 (pUC + E. Cor I) 11 = K2 (pUC hasil isolasi

6 = A1 (pUC + E Cor I)
Migrasi pita pita di elektroforesis

base pairs distance(mm distance unknow bp


(bp) ) log 10 bp unknow m*distance y value value
23130 13 4.364176 36 -0.972 3.711 5140.436516
9416 25 3.973866 35 -0.945 3.738 5470.159629
6557 30 3.816705 33 -0.891 3.792 6194.410751
4361 40 3.639586 35 -0.945 3.738 5470.159629
43 -1.161 3.522 3326.595533
32 -0.864 3.819 6591.738952
35 -0.945 3.738 5470.159629
44 -1.188 3.495 3126.079367
45 -1.215 3.468 2937.649652
43 -1.161 3.522 3326.595533

Metode isolasi DNA dari bakteri (plasmid) biasanya sering kita sebut miniprep yang

singkatan dari mini-preparation. Ada pula yang mengatakan medi-prep. Mini-prep maupun medi-

prep sebenarnya metode yang digunakan sama, tetapi hanya jumlahnya volume saja yang beda.

Kalau yang mini-prep small scale isolation of plasmid, sedangkan medi-prep adalah large-scale

isolation of plasmid.

Kendaraan merupakan salah satu alat untuk memindahkan sesuatu dari satu tempat ke

tempat lain. Dalam bioteknologi rekayasa genetika yang telah melanda dunia saat ini, kendaraan

juga diperlukan dan merupakan kebutuhan mutlak. Kendaraan yang digunakan dalam

bioteknologi ini berfungsi sebagai alat untuk memindahkan gen (sepotong molekul DNA) dari

satu organisme ke organisme hidup lain. Dalam bioteknologi, kendaraan tersebut dikenal dengan

nama vector. Adapun gen yang bisa dipindahkan dapat berasal dari molekul DNA manusia,

hewan, tumbuhan dan semua organisme hidup lainnya. Oleh karena jenis kendaraan ini berasal

dari sel organisme hidup, kita sebut saja kendaraan ini sebagai biotransport.

Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom berupa DNA sirkular. Namun,

disamping memiliki kromosom tersebut, bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang

ukurannya jauh lebih kecil daripada DNA kromosomnya. Materi ini disebut dengan plasmid
yang merupakan DNA bakteri yang terpisah dari DNA kromosomnya. Plasmid merupakan satu

dari beberapa jenis biotransport yang paling populer digunakan dalam bioteknologi rekayasa

genetika. Beberapa karakteristik dari plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak

berujung), berukuran kecil, terdapat dalam sitoplasma namun di luar kromosom (ekstra

kromosom) dan dapat melakukan replikasi secara autonom, secara genetik dapat ditransfer

dengan stabil, mengandung berbagai jenis gen. Jenis, jumlah jenis dan jumlah tiap jenis (copy)

plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid terdapat di

dalam sitoplasma organisme prokariot dan eukariot sederhana uniseluler. Selain dalam bakteri,

plasmid juga terdapat dalam Saccharomyces cerevisiae. Pada kelompok prokariot, plasmid

diketahui memiliki ukuran yang sangat bervariasi antara kurang dari 1 juta Dalton sampai 200

juta Dalton. Sifat fenotipe dari plasmid biasanya telah teridentifikasi, misalnya tahan terhadap

antibiotik, memproduksi antibiotik, degradasi aroma, tahan terhadap logam berat, fermentasi

gula dan lain-lain. Namun, ada pula plasmid yang belum teridentifikasi sifat fenotipe-nya dan

disebut sebagai plasmid cryptic.

Dalam teknik rekayasa genetika, plasmid biasanya digunakan sebagai vektor untuk

kloning. Plasmid juga dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau

transformasi. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen tidak lama setelah

David Jackson, Robert Simon dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu

pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing.

Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang

pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah

dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).


Penamaan plasmid biasanya diawali dengan “p” diikuti oleh serangkaian kode yang

menunjukkan identitas plasmid tersebut. Contoh plasmid yang umum digunakan sebagai vektor

adalah pUC118, pUC119, pBR322. Plasmid-plasmid ini masing-masing membawa gen penanda

resistensi terhadap antibiotik yang dapat digunakan sebagai dasar dalam seleksi koloni yang

membawa plasmid dan yang tidak. Beberapa plasmid memiliki MCS (Multiple Cloning Site)

pada gen lacZ yang menyandikan enzim β-galactosidase, sehingga memungkinkan melakukan

seleksi biru putih. Jika vektor tersebut telah membawa gen tertentu, di belakang nama plasmid

juga disertakan keterangan mengenai gen yang dibawanya (contoh: pAP01 (amyH), berarti

plasmid hasil konstruksi ini mengandung gen amyH).

Untuk mengisolasi DNA plasmid dari keseluruhan genom yang dimiliki oleh bakteri,

biasanya digunakan metode lisis alkali atau sentrifugasi dalam gradien CsCl. Kedua metode ini

akan memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom berdasarkan kerapatannya. Pada metode

lisis alkali, sel bakteri dilisis dalam suasana alkali sehingga dsDNA akan terdenaturasi menjadi

ssDNA. Setelah dinetralkan, DNA plasmid yang berukuran lebih kecil dibandingkan DNA

kromosom akan lebih cepat mengalami renaturasi. Selanjutnya dengan sentrifugasi keduanya

dapat dipisahkan. Metode ini dapat menghasilkan plasmid dengan kemurnian yang tinggi.

Berdasarkan metode lisis alkali, sekarang ini telah banyak dikembangkan suatu kit untuk

isolasi plasmid. Dibandingkan dengan metode lisis alkali konvensional, dengan menggunakan

kit, pekerjaan menjadi lebih cepat dan mudah. Untuk mendapatkan kemurnian yang tinggi,

biasanya kit semacam ini menggunakan agen pengikat DNA dalam bentuk beads atau spin

column yang akan mengikat DNA dengan kuat sehingga pengotor lainnya dapat dihilangkan saat

pencucian. Setelah itu, DNA dapat diperoleh kembali dengan menambahkan suatu larutan yang

dapat melepaskan ikatan antara DNA dengan agen tersebut (proses elusi).
Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang

terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada

umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi

sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa

genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang

diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk

komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua

organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal

(plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel,

organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling

lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang

paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA

memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.


DAFTAR REFERENSI

Anonim, 2009, Isolation of plasmid DNA (pGEX-4T-3) from E. coli XL1-Blue culture using the
QuickPickTM Plasmid DNA kit, www.bnpands.com / www.bionobile.com

Xiuhua Chen, 2003, Isolation of Plasmid DNA Rescued From Single Colonies of Agrobacterium
tumefaciens by Means of Rolling Circle Amplification, International
Society for Plant Molecular Biology
ACARA II.

RESTRIKSI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai

pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu

organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA

rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat

diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah

pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan

DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand

DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi

dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong

dengan enzim restriksi.

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19

2. Enzim restriski (PstI)

3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

4. Tabung mikrosentrifuga

5. Sarung tangan
6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

8. termometer

9. Lemari pendingin (Frezer)

10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom,

yaitu enzim PstI.

2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat

terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam

tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI

3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan

hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan

komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan

PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.

4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik.

Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.

5. tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C

selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).


0
6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 C selama 10 menit

menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.

7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.


HASIL DAN PEMBAHASAAN

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III) 7 = A2 (pUC + Pst I)

2 = K1 (pUC + HindIII) 8 = A3 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cor I) 9 = A4 (pUC)

4 = K3 (pUC + Pst I) 10 = K1 (pUC hasil isolasi)

5 = K4 (pUC + E. Cor I) 11 = K2 (pUC hasil isolasi

6 = A1 (pUC + E Cor I)
Dari hasil praktikum dapat dilihat bahwa plasmid yang disediakan berhasil dipotong oleh

beberapa enzim retriksi. DNA plasmid yang merupakan DNA sirkuler telah berhasil dipotong

menjadi DNA linier yang pada hasil berupa visual sampel larutan DNA plasmid yang diperoleh

menggunakan elektroforesis gel agarosa terlihat seperti 2 pita pada masing masing sumuran.

Kebanyakan molekul DNA dalam sel berukuran lebih besar dari yang diperlukan untuk analisa

DNA di laboratorium. Jika akan mempelajari gen secara individual atau mempelajari situs

individual pada DNA, molekul DNA berukuran besar di dalam sel harus dipotong ke dalam

fragmen-fragmen yang lebih kecil. Pemotongan DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim

endonuklease restriksi. Nuklease ini adalah enzim yang memotong DNA pada tempat tertentu

dengan cara mengenali urutan basa yang spesifik. Enzim restriksi yang digunakan dalam biologi

molekuler umumnya mengenali urutan basa yang pendek (4-8 bp) dan memotong pada posisi

tertentu yang telah ditentukan dalam urutan sekuens DNA tersebut. Contohnya adalah enzim

EcoRI yang ditemukan pada strain Escherichia coli dan merupakan enzim restriksi yang pertama

(I) ditemukan pada spesies ini. Enzim ini mengenali urutan DNA 5′-GAATTC-3′. Jika molekul

DNA yang sama dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda, misalnya oleh HindIII yang

mengenali urutan 6pb (5′-AAGCTT-3′), atau dipotong dengan EcoRI, maka molekul DNA

dipotong pada posisi yang berbeda dan menghasilkan fragmen dengan ukuran yang berbeda .Jadi

sebuah molekul akan menghasilkan sebuah seri karakteristik pola pemotongan DNA saat

dipotong dengan satu set enzim restriksi yang berbeda.

Enzim restriksi jenis lain seperti Sau3A1 yang ditemukan pada bakteri Staphylococcus

aureus mengenali sekuens teramerik (4bp) dengan urutan 5′-GATC-3′ sehingga enzim ini

memiliki frekuensi yang lebih tinggi dalam memotong DNA, kira-kira satu kali dalam 250bp. Di

sisi lain terdapat enzim retriksi yang mengenali sekuens oktamerik (8 bp) yaitu enzim NotI yang
mengenali uruta 5′-GCGGCCGC-3′ dan rata-rata memotong hanya sekali dalam 65 kb. Enzim

restriksi tidak hanya berbeda dalam urutan basa yang dikenali, tetapi juga pada pada struktur

hasil produk pemotongannya. Beberapa enzim seperti HpaI menghasilkan produk dengan ujung

tumpul, enzim lain seperti EcoRI, HindIII dan PstI menghasilkan ujung lengket.

.
DAFTAR REFERENSI

Kristamtini, 2003, Kontruksi Vektor Pemotong S. Cereviceae dengan Gen Penanda hisg-URA 3-
HISG, Jurnal Bioteknologi Pertanian Vol 8 no 1

http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045
ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan

atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain

agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan

ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi

melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin

rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan

memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA

standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di

bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan

larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam

larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun

kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang

terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup

memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi

elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan

untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran

DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.


TUJUAN

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

a. DNA kromosom bakteri,

b. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)

c. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

2. Agarosa

3. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH

8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

4. Akuades

5. Gelas Ukur 1000 ml

6. Labu Erlenmeyer 50 ml

7. Tabung mikrosentrifuga

8. Sarung tangan

9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

10. Kertas parafilm

11. seperangkat alat elektroforesis

12. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;

EDTA 120 mM)

13. larutan Etidium Bromid (EtBr)

14. UV transluminator
15. Kaca mata UV

16. kamera digital

CARA KERJA

No. Keterangan Gambar


1 Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%,

. timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan

asisten)
2 Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20

. mL

3 Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat

. jernih.

4 Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC)

. dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10

mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke

dalam pencetak gel

5 Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke

. dua ujung pencetak gel dan menempatkan

sisir pada salah ujung pencetak gel

6 Tuangkan larutan agarosa ke dalam

. pencetak gel.
7 Setelah gel memadat, pindahkankan gel

. agarosa beserta pencetak gel ke dalam

tangki elektroforesis.

 Sebelum dipindahkan ke

tangki elekstroforesis, selotip pada

kedua ujung pencetak gel dilepas

terlebih dahulu
8 Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah

. dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke

dalam sumur (well) gel agarosa


9 Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda

. warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose

bagian bawah.

1 Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel

0 agarosa di atas UV transillumitor dan tutup

. kaca pelindung dan amati pita DNA

1 Dokumentasikan pita DNA yang tampak

1 menggunakan kamera .

.
HASIL DAN PEMBAHASAAN

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III) 7 = A2 (pUC + Pst I)

2 = K1 (pUC + HindIII) 8 = A3 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I) 9 = A4 (pUC)

4 = K3 (pUC + Pst I) 10 = K1 (pUC hasil isolasi)

5 = K4 (pUC + E. Cory I) 11 = K2 (pUC hasil isolasi)

6 = A1 (pUC + E Cory I)
Migrasi pita pada masing masing sumuran

base pairs distance(mm distance unknow bp


(bp) ) log 10 bp unknow m*distance y value value
23130 13 4.364176 36 -0.972 3.711 5140.436516
9416 25 3.973866 35 -0.945 3.738 5470.159629
6557 30 3.816705 33 -0.891 3.792 6194.410751
4361 40 3.639586 35 -0.945 3.738 5470.159629
43 -1.161 3.522 3326.595533
32 -0.864 3.819 6591.738952
35 -0.945 3.738 5470.159629
44 -1.188 3.495 3126.079367
45 -1.215 3.468 2937.649652
43 -1.161 3.522 3326.595533

Hasil dari berbagai manipulasi DNA dan analisis DNA dapat dimonitor melalui proses

elektroforesis yang merupakan suatu teknik pemisahan senyawa yang bermuatan dengan

meletakkannya pada suatu medan listrik. Separasi material elektroforesis didasarkan pada

perbedaan dalam muatan molekul, ukuran molekul, atau kombinasi antara keduanya. Karena

elektroforesis merupakan pergerakan dari molekul bermuatan listrik pada medan arus listrik

maka molekul bermuatan negatif akan bergerak ke elektroda bermuatan positif (kutub positif)

dan molekul bermuatan positif akan bermigrasi ke arah kutub negatif.


Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA

marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak

jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat.

Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran

sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan

kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena

adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi

pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka

bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang

sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan

DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga

diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi,

kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak

dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena

goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran menunjukkan

adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan

ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya

smear.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip

dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.

Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya

gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam

metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-

blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya

merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat

yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida

dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih

besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut)

yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada

gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-

molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik

sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda

positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk

menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam

nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium

dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel

yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"

(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam
sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar

ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses

pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang

berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang

bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti

bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang

merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan

ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel

yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita

sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap

logaritma ukuran molekul.


DAFTAR REFERENSI

Geraldine, 1978 Application of Agarose Gel Electrophoresis to the Characterization


of Plasmid DNA in Drug-resistant Enterobacteria, Journal of General Microbiology

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/
ACARA IV

PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI

LANDASAN TEORI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang

bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah

karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA

tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

BAHAN ADAN ALAT

1. strain E. coli JM 109

2. media LB cair

3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin

4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG

5. es batu

6. shaker-incubator

7. termometer

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

10. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

12. jarum ose

13. batang drugalsky

14. cawan Petri

15. Erlenmeyer

16. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)


17. kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan

cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi

di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC

selama 16 jam (semalam).

2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml

dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25

ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume

kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan

kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC.

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam

tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl

CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g

selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl

CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini

terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan

3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.

6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl

sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid

pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.


7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi

kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera

dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10

menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC

dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media

cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi

pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin.

Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC.

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang

masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19

sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor

pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung

nomor 5).

11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit

dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42 oC dan segera

dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml,

dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu

37oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl

X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu

37oC selama lebih kurang 30 menit.


14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan

LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.

15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan

cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.

16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media

cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl,

dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.

17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan

koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.

18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut

Dimana,

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)


HASIL DAN PEMBAHASAN

Sel Kompeten (Competent Cells, CC, C-Cells) adalah sel (bakteri atau yeast)

yang telah mengalami perubahan dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya

membran sel dari bakteri atau yeast tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA,

sehingga DNA yang telah masuk tersebut akan bertambah dan bertambah seiring

pembelahan sel mikroba tersebut. Larutan yang digunakan untuk mengubah struktur

tingkat permeabilitas membran tersebut adalah larutan garam, seperti CaCl2, MgCl2,

dan LiCL2.

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut

transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut

transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid

masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka

yang dibawa oleh plasmid tersebut.

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat

kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga

diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel

nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid,

sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid.

Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan

pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada

sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam

medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan

sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat
tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman

saja.

Fungsi penambahan CaCl2 pada pembuatan sel kompeten belum diketahui

secara jelas. Penambahan etanol pada pembuatan sel kompeten menurunkan efisiensi

transformasi. Hal ini dikarenakan adanya leaching terhadap lipopolisakarida dari

dinding sel. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa adsorpsi DNA didukung oleh LPS

dinding sel bakteri. Mekanisme yang diajukan adalah pengikatan DNA pada molekul

LPS sel kompeten dilanjutkan dengan pemasukan DNA ke sitosol karena adanya

disintegrasi membran sel akibat CaCl2 . CaCl2 mempengaruhi dinding sel dan

mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama

menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh

perlakuan kejut panas.

Kultur sel E.coli yang telah mengalami perlakuan MgCl2 dan CaCl2

dalam percobaan ini menjadi sel yang kompeten. Fragmen DNA asing yang

ditransformasikan adalah plasmid. Plasmid ini mengandung gen yang ingin

diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap ampisilin yang

berperan sebagai marka seleksi. Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid

yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69

kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada

gambar .
Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti

berikut:

Gb.1 E.coli non transforman (media+ampisilin)


Gb.2 E.coli Transforman (media+ampilin)

Gb.3 E.coli non transforman (media tanpa ampisilin)

Gb 4. E.coli transforman (tanpa ampisilin)

Kultur sel E.coli yang telah mengalami perlakuan MgCl2 dan CaCl2 dalam

percobaan ini menjadi sel yang kompeten. Fragmen DNA asing yang

ditransformasikan adalah plasmid. Plasmid ini mengandung gen yang ingin

diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap ampisilin yang
berperan sebagai marka seleksi Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut

panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan

menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah

perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri

setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Untuk mengetahui sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan

seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi.

Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya

ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang

telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni

bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni

tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.

Dari Hasil tersebut menunjukkan bahwa E.coli yang tidak ditransformasi

pUC 19 (gambar 1) yang mengandung gen resisten ampisilin mampu tumbuh pada

media LB yang ditambahkan ampisilin dan membentuk 16 koloni. Hal ini harusnya

tidak terjadi, karena E.coli yang ditumbuhkan pada media tersebut tidak resisten

terhadap ampisilin. Tumbuhnya koloni tersebut dimungkinkan amphisilin telah rusak

karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis

atau kurang steril. E.coli yang ditransformasi pUC 19 yang mengandung gen resisten

ampisilin mampu tumbuh pada media LB yang ditambahkan amphisilin (gambar 2),

setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 416 koloni, hal ini dikarenakan bahwa

E.coli tersebut mengandung gen resisten ampisilin yang di transformasi dari pUC 19

yang mengandung gen resisten ampisilin. Sedangkan E.coli yang ditumbuhkan pada

media tanpa ampisilin, baik pada E.coli transforman (gambar 3) maupun non

transforman (gambar 4) mampu tumbuh dan menghasilkan jumlah koloni yang


terlalu banyak untuk dihitung (TBUD). Hal ini dikarenakan pada media tersebut

tidak ada ampisilin sehingga E.coli mampu tumbuh dengan baik. Pada cawan sampel

terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni

tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri

ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju

transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media

seleksi.

Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan

adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel

yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni

bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni

tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.


DAFTAR REFERENSI

http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-

metode-cacl2/http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi

%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf

Wibowo, 2002, Tranformasi Fragmen Dna Kromosom Xanthomonas Campestris Ke


Dalam Escherichia Coli, MAKARA, SAINS, VOL. 6, NO. 1
Lampiran 1. Peta Restriksi DNA pUC19
Lampiran 2. Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin
Miniprep Kit (Qiagen, USA)

@ 3 ml

Inkubasi 370C,
E.coli 25 ml shaker 150
transforman LB rpm, 16 jam
pUC19 1 Sentrifugasi
Sp 5.700xg (5000 rpm), 5'
Cairan
dibuang dibuang
Kolom
pindah + 1 ml STE
resuspensi

Sentrifugasi
+ 500 µl Buffer PB Sp
5000 rpm, 5'
dibuang
Sentrifugasi
+ 50 µl Buffer EB 13.000 rpm, 1'
Cairan + 250 µl Buffer P1
Sentrifugasi dibuang Resuspensi (vortex, bolak balik
13.000 rpm, 1'
+ 250 µl Buffer P2
Bolak-balik sebentar
+ 750 µl Buffer PE
Warna
Sentrifugasi mjd BIRU
13.000 rpm, 5'
Cairan + 350 µl Buffer N3
DNA Bolak-balik sebentar
dibuang
plasmid
Warna
BIRU
hilang
Sentrifugasi Sentrifugasi
13.000 rpm, 1' 13.000 rpm, 1'
Sp
dipindah

Sentrifugasi
13.000 rpm, 1'
Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid

Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005)

No. Komponen P1 P2 P3
1. ddH2O 22,5 µl 22,5 µl 22,5 µl
2. Buffer E 5 µl 5 µl 5 µl
3. BSA 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl
4. DNA
pUC19 20 µl 20 µl 20 µl
5. PstI 2 µl - -
6. HinfI - 2 µl -
7. HindIII - - 2 µl
Jumlah 50 µl 50 µl 50 µl

Keterangan :
P1= volume enzim restriksi sebanyak 0,5 µ
P2= volume enzim restriksi sebanyak 1 µl
P3= volume enzim restriksi sebanyak 1,5 µl
P4= volume enzim restriksi sebanyak 2µl
P5= volume enzim restriksi sebanyak 2,5 µl

1 2 3 4 5 6 7

P1 P2 P3

Spin sebentar,
2”

Ketuk-ketuk

Inkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam

Simpan di
frezer Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menit
Lampiran 4.Skema Keja Pembuatan Gel Agorosa Elektroforesis

Dibuat TAE 1 X 250 ml


(5 ml TAE 50Xke dalam 245 ml akuades)

Agarosa dilarutkan dalam buffer TAE 1X hingga 20 ml


dengan konsentrasi gel agarosa sebesar 1%

Gel agarosa

Dibuat larutan gel agarosa

Dihomogenkan dengan
pemanasan hingga mendidih

Dibuat cetakan gel


Diamkan hingga suhu ±50oC

Ditambah 2 ml etidium Kedua ujung ditutup


bromida selotip

Larutan gel agarosa Sisir elektroforesis dipasang


untuk dibuat sumur
Dituang ke dalam cetakan gel

Gel memadat didalam cetakan

Sisir dan selotip


dilepas
220 ml TAE 1X di dalam
bejana buffer Elektroforesis Gel memadat beserta cetakan
Dimasukkan hingga tenggelam
Lampiran 5. Skema Kerja Elektroforesis Gel Agarosa

Sampel DNA

Dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis

Arus DC dialirkan dari power supply

Migrasi DNA menuju electrode positif

Dilihat pita DNA pada transiluminator UV

Gambar 1. Gel Agarosa Elektroforesis


Lampiran 6. Skema Kerja Pembuatan Sel Kompeten E. coli JM 109

Sp
E. coli JM 09 Sel kompeten, gliserol

Medium LB
Inkubasi ± 16 jam
Overnight
37 0C

Inkubasi ± 16 jam
Overnight
Shaker incubator
Medium LB 150 rpm
LB 25 ml 37 0C
Overnight
E.coli JM 09 Diambil 250 µl

Inkubasi ± 2 jam
Shaker incubator 150 rpm
37 0C
LB cair 25
Masing-masing ml
1,5 µl

Sentrifugasi
5.000 rpm Tabung
5 menit sentrifuga

1 2 3 4 5 6

Dibuang supernatannya
+ 500 CaCl2 (Vortex)
Sentrifugasi 5.000 rpm, 5 Kerja
menit Aseptis

Dibuang supernatannya
+ 200 CaCl2 (Vortex)

Inkubasi :
Tabung 1 dan 2 selama 2 jam Transformasi
Tabung 3, 4 dan5 selama 16 jam
Lampiran 7. Skema Kerja Transformasi E. coli JM 109

Inkubasi 2 jam
Tabung sentrifuga berisi
E.coli JM 09 kompeten
inkubasi 2 jam
1 2

Simpan di ES
2
Tabung sentrifuga
treatment 1 2
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk
pUC 19 10 µl -

1 2 Simpan di ES selama 20 menit

Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik

Simpan segera di ES selama 10 menit

Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)

Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm

100 µl 50 µl
1A 1B
1 2
PLATING 1
Medium LB Amp Medium LB
inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit

2A 100 µl 50 µl 2B

Hitung jumlah koloni yang tumbuh pada 2


medium LB Amp cawan 2A
Medium LB Amp Medium LB
Inkubasi 16 jam
Tabung sentrifuga berisi
E.coli JM 09 kompeten
inkubasi 16 jam
3 4 5

3 5 Simpan di ES
4
Tabung sentrifuga
treatment 3 4 5
dibolak balik Sel E. coli Kompeten 200 µl 200 µl 200 µl
+ ketuk-ketuk pUC 19 10µl - -
pUC 19 rekombinan - 2 µl -

3 4 5 Simpan di ES selama 20 menit

Heat Shock pada 42 0C, selama 90 detik

Simpan segera di ES selama 10 menit

Ditambahkan LB cair hingga 1 ml (±800 µl)

Shaker inkubator pada 37 0C, selama 1,5 jam 150 rpm

PLATING Disentrifugasi 5.000 rpm, ± 5 menit


3 4 5 4
Supernatan dibuang, sisakan 100 µl

100 µl
3A 4A
3 100 µl
4
medium medium
LB/Amp/X-Gal/IPTG LB/Amp/X-Gal/IPTG

100 µl 50 µl
5B
∑koloni × pengencera n = CFU
5A [ pUC 19 ] µg
5
Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)
medium Medium LB
LB Amp [pUC 19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)
Inkubasi pada 37 0C, selama ± 30 menit

Dihitung jumlah koloni putih pada cawan 4A untuk diketahui effisiensi transformasinya
Lampiran 8. Media Pertumbuhan Bakteri

1. Media Cawan Agar Luria-Bertani (LB) 100 ml


- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Agar 2 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.

2. Media Cair Luria-Bertani (LB) 100 ml


- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.

3. Media Cawan Agar Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml


- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl
- Agar 2 gram
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.

4. Media Cair Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml


- Bacto tryptone 1 gram
- Bacto yeast extract 0,5 gram
- NaCl 0,5 gram
- Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl
Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian
diautoklaf.
5. Media Cawan Agar LB/Amp/X-Gal/IPTG
Buat media agar LB/Amp seperti diatas, kemudian ditambahkan 100 μl IPTG 100
mM dan 50 μl X-Gal 50 mg/ml. Ratakan dengan cara dispread hingga kering,
inkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit sebelum digunakan.

Komposisi Bufer dan Larutan

1. TAE bufer 50X (Annymous, http://www.6mgel.com/50x_tae_buffer_1_liter.htm)


- Tris-base 242 g
- Glacial acetic acid 57,1 g
- EDTA 0,5 M pH 8,0 100 ml
Semua komponen dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian
tambahkan HCl untuk menentukan pH 7,6-7,8. Tera dengan akuades hingga
volume akhir 1000 ml. Dapat disimpan pada suhu ruang.

2. Loading buffer 6X (Anonymous, http://www.bioron.net/products/dna-and-dna-


markers/loading-buffer/)
- Bromophenol blue 0,25%
- Xylene cyanol 0,25%
- Ficoll tipe 400 15%
- EDTA 120 mM
Semua komponen dilarutkan hingga homogen. Dapat disimpan pada suhu ruang.

3. Larutan stok IPTG (0,1 M) (Promega, 2003)

- IPTG 1,2 g
Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian
simpan pada 4o C.

4. Larutan X-Gal (2 ml) (Promega, 2003)

- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg
Larutkan dalam 2 ml N,N'-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil
kemudian simpan dalam -20o C.