ISOLASI PLASMID SEBAGAI VEKTOR KLONING Gα (SL16)

NINDA NINGTYAS
P051190191

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2019
 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

DNA terbagi menjadi dua yaitu DNA kromosom dan DNA

ekstrakromosomal seperti DNA mitokondria, kloroplas dan plasmid. Plasmid
adalah DNA ektrakromosomal yang dapat bereplikasi secara mandiri dan
ditemukan dalam sel prokariot dan eukariot. Dalam sel bakteri plasmid biasanya
ada dalam bentuk superkoil, tetapi setelah dilakukan lisis alkali dan elektroforesis,
mereka dapat ditemukan dalam bentuk linear, open circle, dan multiple-
supercoiled (Bauer dan Crick, 1980).
Plasmid bakteri ukurannya bervariasi berkisar antara 1 kb sampai 200 kb.
Dalam penelitian rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk
mengklonkan gen. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen
DNA asing ke dalam sel inang (Palomares et al. 2004; Yadav et al. 2011).
Plasmid mempunyai 3 komponen penting yaitu: 1) Origin of replication (ORI),
sehingga plasmid dapat mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom,
2) memiliki daerah unik sebagai situs pemotongan enzim endonuclease, yang
biasa disebut multiple cloning site (MCS), 3) membawa penanda seleksi (biasanya
resistensi terhadap antibiotika) untuk membedakan antara sel inang yang
mengandung plasmid atau tidak. Berdasarkan fungsinya menurut Calladine (2014)
plasmid dapat dikelompokkan menjadi 5, yaitu: 1) fertility- F plasmids, 2)
resistance- R plasmids, 3) plasmid penyandi bacteriocins, 4) degradative
plasmids, dan 5) virulence plasmids. Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di
dalam sel dapat dibedakan menjadi low copy number plasmid dan high copy
number plasmid. Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam,
antara lain: 1) supercoiled (covalently closed-circular), 2) relaxed circular, 3)
supercoiled denature, dan 4) nicked open circular (Campbell, 2002).
Secara umum, inti dari isolasi plasmid adalah isolasi plasmid bertujuan
mengekstrak plasmid dan memisahkannya dari berbagai komponen selular bakteri
lainnya, seperti protein, lemak, RNA, dan DNA kromosomal dengan cara
menghancurkan membran sel agar semua organel sel dapat keluar. (Lodish, 2000).
Metode isolasi plasmid yang tepat sangat penting untuk mendapatkan plasmid
dengan konsentrasi dan kemurnian yang tinggi. Beberapa metode isolasi plasmid
antara lain: lisis alkali, lisis dengan pemanasan, menggunakan bahan kimia sesium
klorida, metode dengan menggunakan microwave (Dederich et al. 2002), dan
metode kromatograpi (Birnboim dan Doli 1979). Pada kegiatan ini plasmid
diisolasi daribakteri E. coli menggunakan metode alkaline lysis. Metode alkaline
lysis secara garis besar terbagi ke dalam enam tahap, yakni tahap kultivasi bakteri
dan pemanenan sel, tahap resuspensi sel, tahap lisis sel dan denaturasi DNA, tahap
netralisasi, tahap purifikasi, dan tahap pemekatan DNA (Davis, 2012).
Isolasi DNA plasmid sangat penting dalam rekayasa genetika karena
merupakan langkah awal yang harus dilakukan dari proses pengklonan di mana
plasmid memiliki peran yang sentral sebagai vektor untuk pengganda. Oleh
karena itu keberadaan plasmid merupakan hal yang terpenting dalam teknik DNA
rekombinan. Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari
keberhasilan isolasi DNA plasmid dari bakteri. Dengan demikian perlu adanya
2

metode yang tepat sehingga perlu adanya penelitian untuk mengetahui metode
isolasi serta analisis kualitas DNA hasil isolasi plasmid tersebut. Dengan harapan
akan mendapatkan hasil yang maksimal dan dapat dijadikan sebagai bahan untuk
penelitian bidang terkait. Berdasarkan uraian diatas maka perlu dilakukan
praktikum mengenai isolasi DNA plasmid.

Tujuan Penelitian

Praktikum isolasi plasmid bertujuan mengisolasi fragmen DNA dari bakteri

Escherichia coli Gα, serta melihat kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh
menggunakan metode elektroforesis dan spektrofotometri.

2 METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum isolasi plasmid dilaksanakan pada tanggal 20 sampai dengan 29

Agustus 2019 pukul 11.00-16.00 WIB. Praktikum ini dilakukan di laboratorium
Biorin gedung Pendidikan Antar, Institut Pertanian Bogor.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung eppendorf 1.5
mL, micropippete (100 µL, 200 µL, dan 1000µL), MaxiMix®II vortex mixer,
sentrifus, freezer, spektrofotometer, microwave, perangkat elektroforesis, tabung
erlenmeyer, timbangan analitik, spindown, dan gel doc.
Bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi plasmid adalah kultur bakteri
Escherichia coli Gα, larutan Sol 1 (25 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EDTA 15%
Saccharose), larutan Sol 2 (200 mM NaOH, SDS 1%), larutan Sol 3 (3 M natrium
asetat pH 4.7), es batu, larutan P:C:I (fenol, kloroform, dan isoamil alcohol
dengan perbandingan 25:24:1), etil alcohol (100%dan 70%), RNAase, gel agarosa
1%, EtBr (Etidium Bromida), ddH2O, Buffer Tris-Asetat-EDTA (TAE).

Prosedur

Isolasi DNA Plasmid

Kultur bakteri yang digunakan, yaitu Escherichia coli yang mengandung
plasmid PGEM-T easy. Isolat bakteri yang mengandung DNA plasmid dikultur
dalam media cair selama 18 jam kemudian diambil menggunakan mikropipet
sebanyak 1.5 ml ke dalam microtube. Sel bakteri tersebut selanjutnnya pisahkan
dengan medianya menggunakan sentrifugasi pada 5.000 rpm selama 5 menit pada
suhu 20 ○C. Pelet yang diperoleh kemudian ditambahkan dengan 100 µL SOL 1
(Tris HCl pH 7.5 + EDTA) yang telah didinginkan dengan es lalu divorteks atau
diresuspensi dengan pipet sampai homogenkan. Setelah homogen, ditambahkan
 3

SOL 2 (0.2M NaOH, 1% SDS) sebanyak 200 µL kedalam microtube, kemudian

dihomogenkan dengan cara dibolak-balik kurang lebih 10 kali, lalu diinkubasi
selama 5 menit dalam kotak es. Langkah selanjutnya, sebanyak 150 µL SOL 3
(1.32 M Na-asetat pH 4.8) ditambahkan kedalam microtube, dibolak-balik
perlahan kurang lebih 10 kali, lalu diinkubasi di dalam kotak es selama 10 menit.
Setelah proses inkubasi selesai dilakukan, sampel tersebut disentrifugasi pada
10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 20 ○C. Sebanyak 300 µL supernatant
diambil dan dipindahkan pada microtube yang baru lalu ditambahkan P:C:I
(Phenol-chloroform-isoamylalkohol) sebanyak 1x volume supernatan yang
diambil, kemudian dihomogenkan dengan cara dibolak-balik atau divorteks.
Setelah homogen, sampel tersebut disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm selama
10 menit pada suhu 20 ○C. Fase atas diambil kembali dari hasil sentrifuge dan
ditambahkan 1000 µL EtOH (etil alcohol) 100%, dibolak balik perlahan, lalu di
freezer overnight..
Setelah tahap freezer overnight kemudian sampel disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 rpm, pada suhu 4°C selama 25 menit. Selanjutnya pelet yang
diperoleh ditambahkan 500 µl EtOH 70% dan disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 10.000 rpm, pada 4°C selama 5 menit. Kemudian Pelet DNA plasmid
yang diperoleh dikeringkan dalam oven 60°C selama 10-15 menit. Kemudian
ditambahkan 15-20 µl dH2O dan RNAse sebanyak 0.2 x volume (1 mg/mL).
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C selama 10 menit. DNA plasmid yang
berhasil diisolasi dianalisis kemurnian dan konsentrasinya dengan elektroforesis
dan spektrofotometer.

Pembuatan Agarose
Gel agarose 1% dibuat dengan melarutkan 0.35 gram agarose kedalam 35
ml buffer TAE (Tris-HCl pH 8.3 40 mM, asam asetat pekat 1.98 mM, EDTA 1
mM), dipanaskan pada microwave 100oC hingga bubuk agarose tercampur selama
1 sampai 2 menit. Setelah suhu gel agarose tidak terlalu panas, gel dituangkan ke
dalamgel tray (cetakan gel) dan di pasang sisir untuk membuat sumuran. Setelah
gel mengeras, sisir dilepas kemudian gel dipindah kedalam electroforesis chamber
yang sudah diisi dengan buffer TAE.

Uji Kualitatif DNA Plasmid Metode Elektroforesis

Plasmid hasil isolasiakan dielektroforesis pada gel agarose 1% (b/v).
Praktikum kali ini digunakan 2 marker λ dengan konsentrasi masing-masing 1 µl
dan 3 µl. Sebanyak 5 µl DNA plasmid dihomogenkan dengan 1 µl larutan loading
dye diatas kertas parafilm dengan cara dipipeting, lalu dengan hati-hati
dimasukkan ke dalam masing-masing sumur pada gel agarosa. Selanjutnya
running dengan tegangan 100 volt selama 25 menit menggunakan fase gerak
berupa buffer TAE.. Setelah itu gel direndam dalam larutan EtBr (Etidium
Bromide) selama 10 menit. Gel hasil elektroforesis divisualisasikan dalam
GelDoc/Transluminator. Pita DNA yang tergambar menjadi indikasi berhasil atau
tidaknya proses isolasi dna plasmid.

Uji Kuantitatif DNA Plasmid Metode Spektrofotometri

Konsentrasi larutan DNA plasmid diukur secara spektrofotmetri pada
panjang gelombang λ260 nm. Kemurnian DNA dihitung berdasarkan rasio
4

absorbansi pada panjang gelombang λ260 nm dan λ280 nm. Uji ini dilakukan
dengan blanko berupa aquades sebanyak 700 µl dan suspensi DNA plasmid yang
sebanyak 3 µl ditambahkan dengan 697 µl ddH2O. Nilai absorbansi pada panjang
gelombang 260 nm dikonversikan kedalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 µg/ml.
DNA dikatakan murni apabila tingkat kemurniannya berada diantara 1.8 – 2.0.
g
Konsentrasi DNA =Abs. λ 260×50 µg/mL ×faktor pengenceran
ml
Abs.λ 260
Kemurnian DNA=
Abs.λ 280

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Secara garis besar prinsip yang digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid
adalah sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini dilakukan dengan menghancurkan dan
mengekstraksi membran sel supaya semua organel sel dapat keluar sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian
ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung plasmid
(Blackwell, 1997). Isolasi DNA plasmid memiliki beberapa tahapan, yaitu: (1)
isolasi sel; (2) lisis dinding dan membran sel; (3) ekstraksi dalam larutan; (4)
purifikasi; dan (5) presipitasi.Isolasi plasmid diawali dengan kultivasi bakteri
yang mengandung plasmid yang akan diisolasi. Untuk inang E. coli, umumnya
bakteri dikultur selama 16-18 jam pada fase eksponensial agar memperoleh
jumlah sel yang memadai sebagai sumber plasmid. Setelah kultur bakteri
dimasukkan kedalam tabung eppendorf kemudian dengan sentrifugasi. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga

Gambar 1 UjikualitatifDNA plasmidmetodeelektroforesis

 5

substansi yang lebih berat akan berada di

dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan
akan terletak di atas seperti yang terlihat
pada Gambar 1. Setelah tahap kultivasi dan pemanenan
sel dilakukan resuspensi sel dengan menggunakan

larutan alkaline lysis 1. Larutan

alkaline lysis 1 ini berfungsi untuk memecah

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel

sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal
serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus
dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya.
DNA plasmid diisolasi dengan metode lisis alkali(Sambrook dan Russel,2001).
Identifikasi secara kualitatifdilakukan dengan elektroforesis gel agarosa.
Darielektoforegram pada gambar 1, tampak pita DNA plasmid terletakdiantara
pita berukuran ......, sebagai mana yang terdapatpadamarker lambda. Dariukuran
tersebut dapatdiperkirakan bahwa ukuran pita dna plasmid yang diperoleh
sekitar....

Isolasi dna plasmid dengan metode lisis alkali meliputi proses resuspensi
sel, lisis sel, dan neutralisasi(Sambrook dan Russell, 2001).

PenggunaanPage Break
6

Bab yang barutidakharusditulispadahalamanbaru,

termasukpenulisanDaftarPustaka. Jikababbaruinginditulispadahalamanbaru, page
break disarankanuntukdigunakan. Padabeberapakasus,
penuliskaryailmiahmemberikanbeberapabariskosongpadahalaman yang
beradatepat di babbarutersebut. Hal
tersebuttidakefisienkarenaapabiladilakukanpengubahanpadabagian di atasnya,
awalbabbaruakanturun. Untukmempermudah, gunakanfiturpage break. Page
breakdapatdimasukkandenganmemilih menu page layout  breaks  page
breaks (Error! Reference source not found.). Denganpage breaks,
posisijudulbabpadaawalhalamantidakakanmengalamiperubahanwalaupunbagianse
belumhalamantersebutmengalamiperubahan.

4 KESIMPULAN

Simpulan merupakan jawaban dari tujuan yang sudah ditentukan dan tidak
dimaksudkan sebagai ringkasan hasil. Dalam Simpulan, penulis harus dan hanya
menjawab masalah dan tujuan penelitian yang telah dirumuskan pada
Pendahuluan. Simpulan merupakan generalisasi dari hasil penelitian dan
argumentasi penulis, atau pernyataan singkat yang merupakan hakikat dari bab
Hasil dan Pembahasan atau hasil pengujian berbagai hipotesis yang berkaitan.
Simpulanmerupakanhasilpenelitian yang
bolehjaditelahdikemukakandalamperumusanmasalahdantelahdiberijawabansement
araberupahipotesis. Dalammenulissimpulan, penulisharusmembedakandugaan,
temuan, dansimpulanhasilstudi.
Pernyataansimpulanharusdilakukansecaracermatdanhati-hati.
Penyampaiansimpulaninidapatdilakukansebanyak 3 kali, yaknidalamPembahasan,
Simpulan,

Tabel1 Ujikuantitatif DNA Plasmidmetodespektrofotometri

Absorbansi Konsentrasi DNA
Sampel Kemurnian
λ 260 nm λ 280 nm (ng/µL)
1 1.194 0.627 1.904 13930
2 1.026 0.554 1.851 11970
3 1.133 0.597 1.897 13218
4 0.961 0.517 1.858 11211
5 1.366 0.752 1.816 15936
6 0.520 0.285 1.824 6066
7 0.944 0.502 1.880 11013
8 0.931 0.499 1.865 10861

ContohPerhitunganKemurnian
A λ260 0.961
= =1.858
A λ280 0.517

ContohPerhitunganKonsentrasi DNA
700
= ×50 × A λ260
3
700
= ×50 × 0.961
3
=13218ng/µL
 7

danAbstraksehinggadiperlukankecermatanuntukmenyajikannyadenganungkapan
yang berbeda-beda.

DAFTAR PUSTAKA

Bente AD, Rico-Hesse R. 2006. Model of dengue virus infection. Drug Discov
Today Dis Models. 3(1):97-103. doi: 10.1016/j.ddmod. 2006.03.014.
Bernardo L, Izquierdo A, Prado I, Rosario D, Alvarez M, Santana E, Castro J,
Martinez J, Rodriguez R, Morier L et al. 2008. Primary and secondary
infections of Macacafascicularis monkey with Asian and American genotypes
of dengue virus 2. Clin Vaccine Immunol. 15(3): 439-446. doi:
10.1128/CVI.00208-07.
Kochel TJ, Watts DM, Gonzalo AS, Ewing DF, Porter KR, Russell KL. 2005.
Cross-serotype neutralization of dengue virus in Aotusnancyme monkeys. J
Infect Dis. 191(6):1000-1004. doi:10.1086/427511.
Onlamoon N, Noisakran S, Hsiao HM, Duncan A, Villinger F, Ansari AA, Perng
GC. 2010. Dengue virus-induced hemorrhage in a nonhuman primate model.
Blood. 115(9):1823-1834. doi:10.1182/blood-2009-09-241990.
[WHO] World Health Organization. 2009. Dengue and dengue haemorrhagic
fever [internet]. [diacu 2009 Mei 6]. Tersediadari: http://www.who.int
/mediacentre/ factsheets/ fs117/en/ index.html.

Inicumacontohdapusaja