Laporan Praktikum

Teknologi Asam Nukleat

dan Protein

Hari,Tanggal
Waktu
PJP
Asisten

: Rabu, 8 November 2016

: 08.00-10.00 WIB
: Puspa JP
: Efdian Dwi J
Arunya Rizki W
M. Munasir
Hafiz Nalfiando

ISOLASI DNA PLASMID DAN KROMOSOM

Muhammad Rifai Anugrah

G84130016

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2016

PENDAHULUAN
Kromosom merupakan struktur nukleoprotein. Struktur ini membawa
informasi genetik dan terletak di dalam inti sel berbentuk genom. Terdapat dua
macam kromosom pada suatu organisme. Kromosom yang pertama adalah
kromosom seks (gonosom) dan Kromosom tubuh (autosom). Kromosom seks
merupakan struktur yang menentukan jenis kelamin, sedangkan kromosom tubuh
tidak menentukan jenis kelamin. Kromosom memiliki dua fungsi utama, yaiyu
untuk memastikan DNA terpisah dalam porsi yang sama pada setiap pembelahan
sel dan untuk menjaga integritas dan ketepatan replikasi genom pada setiap siklus
sel. Elemen yang bertanggung jawab terhadap proses ini adalah sentromer, telomer,
dan unit replikasi (Passarge 2007).
DNA yang berikatan dengan beberapa protein histon akan membentuk
kromosom. Ikatan ini akan mengasilkan nukleosom. Nukleosom memiliki ukuran
sekitar 10 nm. Nukleosom akan membentuk lilitan-lilitan yang sangat banyak,
lilitan ini akan menjadi penyusun dari kromatid (lengan kromosom). Satu lengan
kromosom ini memiliki lebar sekitar 700 nm. Struktur kromosom terdiri dari empat
bagian, yaitu kromatid yang merupakan bagian lengan kromosom yang terikat satu
sama lainnya(Firth dan Hurst 2005); sentromer yang merupakan daerah tidak
mengandung informasi genetik. Sentromer merupakan struktur yang sangat penting,
karena bagian inilah lengan kromosom (kromatid) saling melekat satu sama lain
pada masing-masing bagian kutub pembelahan(Firth dan Hurst 2005); Kromomer
adalah struktur berbentuk manik-manik yang merupakan akumulasi dari materi
kromatid yang kadang-kadang terlihat pada pembelahan masa interfase. Pada
kromosom yang telah mengalami pembelahan berkali-kali, biasanya kromomer ini
sangat jelas terlihat (Firth dan Hurst 2005); dan yang terakhir adalah telomer.
Telomer adalah bagian berisi DNA pada kromosom, fungsinya untuk menjaga
stabilitas ujung kromosom agar DNA nya tidak terurai (Firth dan Hurst 2005).
Kromosom berdasarkan letak sentromernya dapat dibedakan menjadi empat,
yaitu talosentrik. kromosom yang sentromer nya terletak di ujung kromosom;
metasentrik, kromosom yang sentromer nya terletak di tengah kromatid sehingga
secara relatif membagi kromatid menjadi dua bagian; submetasentrik, kromosom
yang letak sentromernya mendekati bagian tengah, namun tidak pada bagian tengah,
sehingga kromatid nya terlihat sedikit panjang sebelah; dan akrosentrik, kromosom
yang letak sentromer nya berada diantara tengah dan ujung lengan kromatid (Firth
dan Hurst 2005).
Plasmid merupakan salah satu vektor yang biasa digunakan dalam proses
pengklonan gen dan terdapat di luar kromosom. Vektor merupakan pembawa
molekul DNA di dalam proses pengklonan gen. Plasmid adalah molekul DNA utas
ganda sirkuler yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat
melakukan replikasi secara autonom. Haisl replikasi plasmid dapa disalurkan secara
genetik dengan stabil (Royston dan Clowes 1972).
Plasmid memiliki ukuran sekitar 1 300 kb, sehingga dapat dibedakan
dengan mudah dari kromosom bakteri yang berukuran 3000 5000 kb. Plasmid
yang terlibat dalam proses konjugasi (plasmid F) biasanya berukuran besar. Untuk
replikasi plasmid dapat berada dalam keadaan terpisah dari kromosom (non-

integratif) dan terintegrasi dalam kromosom bakteri (episom) (Royston dan Clowes
1972).
Plasmid banyak terdapat pada sitoplasma organisme prokariot dan eukariot
uniseluler. Selain terdapat dalam bakteri. Plasmid dapat dikelompokkan
berdasarkan sifat yang disandi oleh gen yang dikandungnya, yaitu plasmid F
(fertilitas) membawa gen tra, yang bertanggung jawab terhadap proses konjugasi;
plasmid R (resistensi) mengandung gen resistensi terhadap antibiotic atau logam
berat; plasmid yang mengandung gen penyandi toksin dan bakteriosin seperti
ColE1 dari E.coli; plasmid degradatif yang mempunyai kemampuan untuk
melakukan metabolisme molekul organik seperti toluena; dan plasmid virulensi
yang bertanggung jawab terhadap patogenitas dari sel inang (Royston dan Clowes
1972).
Isolasi kromosom dan plasmid, serta pemotongannya merupakan proses
yang penting dalam pemurnian plasmid. Plasmid dengan kualitas tinggi sangat
dibutuhkan dalam produksi berbagai produk dengan teknologi DNA rekombinan
(Kotchoni et al. 2003). Selain itu, produksi tersebut tidak hanya digunakan dalam
skala laboratorium, namun juga dalam skala industri. Oleh karena itu, praktikum
ini bertujuan agar praktikan memahami prinsip dan cara mengisolasi kromosom
plasmid, memotong plamid, dan analisis visualisasi plasmid dengan metode
elektroforesis.

METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Praktikum dilakukan pada hari Rabu, 14 September sampai 19 Oktober 2016
pukul 13.00 WIB sampai selesai di Laboratorium Pendidikan Departemen Biokimia
IPB.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan yaitu mortar, perangkat elektroforesis, sentrifus,
tabung sentrifus, neraca,pipet mikro, tip, tabung effendorf, gelas piala, labu takar,
pH meter, tabung Erlenmeyer, gelas piala, Uv transiluminator, incubator dan vortex.
Bahan-bahan yang digunakan adalah daun jahe merah, daun kunyit, Tris Hcl
25 mM, EDTA 10 mM, sukrosa 15 %, NaOH 0.2 M, SDS 1 %, larutan Na asetat 3
M pH 4.6, larutan fenol:kloroform, etanol absolut, etanol 70 %, dH2O steril,
akuades, media NB, 0.5 g ekstral khamir, 1 g tripton, 0.5 g NaCl, 50 ppm ampicillin,
DNA plasmid, Buffer restriksi, enzim retriksi, pewarna Etbr, buffer ekstraksi,
buffer lisis 1 (SDS 20 %), buffer lisis 2 (potassium asetat 5 M), larutan
kloroform;isoamilalkohol (24:1), alcohol dingin 100%, buffer TE, agarosa, asam
borat, loading dye, es batu dan DNA marker 1 kb.
Prosedur
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Plasmid

5
Larutan isolasi DNA plasmid terdiri dari larutan 1 (Tris-HCl 1 M pH 7.5,
EDTA 0.5 M, Sukrosa 20%), larutan 2, larutan 3, buffer TE, dan Nutrient Broth
(NB).
Stok Tris-HCl 1 M pH 7.5 pada larutan 1. Dibuat dari 3.0285 g Tris-HCl
yang dilarutkan dalam 25 mL akuades. Stok EDTA 0.5 M dibuat dari 4.655 g EDTA
yang dilarutkan dalam 25 mL akuades. Stok sukrosa 20% dibuat dengan melarutkan
5 g sukrosa dalam 25 mL akuades. Larutan 1 akhir dibuat dengan mencampur 1,25
mL Tris-HCl, 2 mL EDTA dan 37.5 mL sukrosa dan dilarutkan dengan akuades
hingga volume akhirnya 50 mL.
Stok NaOH 0.2 M larutan 2. Dibuat dari 0.5 g NaOH yang dilarutkan dalam
25 mL akuades. Stok SDS 1% dibuat dengan melarutkan 2.5 g SDS dalam 25 mL
akuades. Larutan 2 akhir dibuat dengan mencampur 20 mL NaOH dan 5 mL SDS
1% lalu dilarutkan dengan akuades hingga volume akhirnya 50 mL.
Na-asetat 3 M pH 4.6. Dibuat dengan melarutkan 6.1570 g Na-asetat dalam
akuades lalu diadjust pHnya dengan asetat glasial hingga pH menjadi 4.6 lalu
akuades ditambahkan hingga volume akhirnya 25 mL.
Buffer TE. Dibuat dengan mencampur Tris-HCL dan EDTA dengan
konsentrasi sama yaitu 0.025 M
Stok Nutrient Broth (NB). Dibuat dengan melarutkan 3.25 g bubuk NB
dalam 250 mL akuades dan stok ampisilin dibuat dengan melarutkan 0.05 g dalam
100 mL akuades (50 ppm). Larutan akhir NB dibuat dengan melarutkan 32 mL NB
dan 8 mL ampisilin sehingga kelarutan ampisilin menjadi 10 ppm dalam 40 mL.
Isolasi dan pemurnian DNA plasmid
Kultur bakteri yang telah dibiakkan semalaman dalam media NB (Nutrient
Broth) sebanyak 1.5 mL di pipet ke dalam tabung eppendorf lalu disentrifugasi
8.000 rpm selama 3 menit. Pelet diambil dan dicuci 3 kali dengan buffer TE dengan
perbandingan 1 mL Tris HCl dan 1 mL EDTA. Larutan 1 ditambahkan ke
supernatan sebanyak 1 mL kemudian larutan divorteks sehingga pelet tersuspensi.
Tabung diinkubasi di atas es selama 5 menit kemudian ditambahkan larutan 2
sebanyak 2 mL lalu tabung ditutup dan isinya dihomogenkan dengan membolakbalik tabung. Tabung disimpan di atas es selama 5 menit dan ditambahkan larutan
3 sebanyak 1.5 mL lalu tabung ditutup dan dibolak-balik agar homogen kemudian
diinkubasi di atas es selama 5 menit. Tabung lalu disentrifugasi selama 10 menit
pada suhu 4C dan diambil supernatannya kemudian ditambahkan larutan
fenol/kloroform sebanyak 300 L. Supernatan kemudian divorteks lalu
disentrifugasi selama 5 menit. Lapisan atas dipindahkan ke tabung eppendorf baru
dengan hati-hati lalu ditambahkan etanol absolut 1 mL kemudian divorteks dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tabung disentrifugasi selama 5 menit,
diambil peletnya dan disuspensi dengan 1 mL etanol 70% lalu divorteks 1 menit
dan disentrifugasi. Pelet diambil dan dikeringkan lalu disuspensi dalam 20-50 L
dH2O/ Buffer TE (10 mL Tris HCl pH 7.5-8 dan 1 mM EDTA).
Pembuatan Larutan Isolasi DNA Kromosom
Pembuatan buffer lisis 1 dibuat dari 10 g SDS yang diencerkan dalam labu
takar 50 mL sehingga konsentrasinya menjadi 20%. Buffer lisis 2 dibuat dari 24.53
g K-asetat yang dilarutkan dalam 50 mL akuades sehingga konsentrasinya menjadi
5 M. Buffer ekstraksi terdiri dari akuades steril, Tris-HCl 1 M pH 8, EDTA 0.5 M

pH 8, NaCl 5 M, CTAB 2%, -merkaptoetanol 2% dan buffer TE 0.01 M pH 7.6.

Stok Tris-HCl 4 M diencerkan menjadi 1 M dengan melarutkan 625 mL stok dalam
25 mL akuades steril. Stok EDTA 0.79 M diencerkan menjadi 0.5 M dengan
melarutkan 15.82 mL stok dalam 25 mL akuades steril. NaCl 5 M dibuat dari 7.3125
g serbuk NaCl yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. CTAB 2% dibuat dari
0.5 g CTAB yang dilarutkan dalam 25 mL akuades steril. -merkaptoetanol 2%
dibuat dengan melarutkan 0.5 mL larutan dalam 25 mL akuades steril. Buffer TE
dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 7.6 dicampur 1 mM Na2EDTA.2H2O pH 8.
Isolasi Kromosom Daun Jahe Merah dan Kunyit
Daun Jahe merah dan kunyit dipotong-potong dan digerus sampai halus
dalam mortar yang disimpan dalam baskom yang diisi es. Hasil gerusan dimasukan
ke tabung effendorf. Kemudian ditambahkan buffer ektraksi dengan volume 4 kali
volume awal sampel dan 50 L larutan buffer 1. Selanjutnya panaskan pada suhu
65 oC selama 15 menit. Kemudian ditambahkan 100 L larutan buffer 2 dan kocok
selama 10 menit dan sentrifus pada kecepatan 14000 rpm selama 5 menit.
Supernatan hasil sentrifus dipindahkan pada tabung effendorf baru dan pellet
dibuang. Selanjutnya supernatant ditambahkan larutan kloroform sebanyak
setengah dari volume awal sampel. Tabung dibulak balik sampai homogen dan
disentrifus kembali dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit. Supernatan
dipindahkan pada tabung effendorf baru dan ditambahkan larutan isopropanol
dingin sebanyak 2 kali volume awal sampel. Selanjutnya tabung didiamkan dalam
wadah berisi es selama 30 menit dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan
14000 rpm dalam waktu 5 menit. Supernatant dibuang, kemudian pellet
ditambahkan dengan 1 mL etanol dan dihomogenkan dengan cara membolak balik
tabung. Selanjtnya dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14000 rpm
dalam 5 menit. Supertanan dibuang, dan pellet dikeringkan dengan cara
membalikan tabung. Setelah kering, pellet ditambahkan dengan 50 L larutan TE
maka didapatkan DNA kromosom. DNA kromosom tersebut didimpan pada lemari
es.
Pemotongan DNA Plasmid dengan Enzim Retriksi
Sebanyak 16 L NFW (Nuklease Free Water) dimasukan kedalam tabung
effendorf dalam keadaan dingin. Selanjutnya ditambahkan 2 L buffer enzim, 1
L DNA plasmid dan 1 L enzim retriksi. Setiap penambahan larutan dilakukan
homogenasi dengan pipeting. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam.
Kemudian ditambahakan Etbr dan diinkubasi kembali pada suhu 65 sampai 70 oC
selama 1 jam. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan 75 sampai 100 volt
selama 1 sampai 2 jam. Hasil plasmid pemotongan dibandingkan dengan DNA
plasmid utuh.
Pembuatan Larutan dan Gel untuk Elektroforesis Agarosa
Larutan buffer TBE 5X dibuat dari Tris HCl 1 M pH 8.3, asam borat 0.83 M
dan EDTA 10 mM. Gel agarosa terbuat dari agarosa yang ditimbang 0.5 g lalu
dilarutkan dalam 50 mL buffer TBE 5X. Gel lalu dituang ke dalam cetakan gel
agarosa dan setelah membeku diletakkan ke dalam tangki elektroforesis yang telah
diisi buffer TBE 5X sampai gel terendam.

7
Elektroforesis Gel Agarosa
Sebanyak 5 L masing-masing DNA dicampur dengan 1 L loading dye lalu
disuspensi. Suspensi loading dye diinjeksi ke dalam sumur pada gel elektroforesis.
Power supply perangkat elektroforesis DNA dengan voltase 60 V selama 2 jam
dinyalakan setelah semua sumur terisi. Gel hasil elektroforesis diangkat dan
divisualisasi menggunakan transiluminator.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA/RNA total biasanya juga disebut dengan isolasi
DNA/RNA kromosom. Isoloasi ini merupakan langkah awal yang harus dikerjakan
dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar
isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel
jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan
pelet sel yang mengandung DNA/RNA total (Faatih 2009).
Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total
DNA/RNA dari jaringan. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid
adalah dengan menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid
rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga
isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan serangkaian
perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni. Homogenisasi sel akan
menghasilkan DNA utuh karena proses ini menyebabkan disrupsi sel dan
tercucinya komponen-komponen sel lain selain DNA. Penambahan kloroform
setelah sentrifugasi memisahkan larutan menjadi fase cair dan padat dimana fase
cair merupakan DNA dan fase padat adalah campuran protein dan DNA (Faatih
2009).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA
eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Pada isolasi
DNA, pengerjaannya harus sangat hati-hati karena DNA sangat mudah rusak oleh
enzim DNAse yang terdapat pada kulit, saliva maupun air mata pemeriksa. Oleh
karena itu selama pengerjaan harus mengenakan sarung tangan dan tidak terlalu
banyak berbicara (Faatih 2009).
Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS
(sodium dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding
atau membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa
berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single
strain). Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid,
RNA, Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan
adanya penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan
untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform
berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan
dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah
tiga fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid

berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase PhenolChloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya
besarFenol digunakan untuk mengendapkan komponen protein lain yang tidak
dikehendaki sedangkan etanol 70% sebagai pencuci hasil isolasi (Faatih 2009).
Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat
untuk menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya
terikat pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang
didapat kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian
disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan
resuspensi karena apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena
pH nya tidak netral lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan
sisa-sisa fragmen RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan
bantuan larutan buffer (Faatih 2009).
Gambar 1 menunjukkan hasil kualitatif isolasi plasmid pGEMT dai E.coli.
Ukuran plasmid dari meja satu samai enam menunjukkan hasil yang sama. Ukuran
plasmid yang didapatkan melebihi 10000bp. Plasmid yang digunakan berasal dari
bakteri E. Coli. Plasmid E. Coli diketahui memiliki jumlah salinan plasmid yang
tinggi dan terbaik diantara bakteri lainnya. Selain itu, E. Coli sangat mudah
ditumbuhkan dan memiliki situs pemotongan yang berada pada daerah resisten
terhadap beberapa antibiotik seperti ampicillin, kanamicin, tetrasiklin, and
kloramfenikol (Preston 1987). Proses isolasi DNA kromosom pada parktikum kali
ini menggunakan kunyit karena memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat
lebih jelas (Artama 1991). Gambar 2 menunjukkan laju elektroforesis kunyit
dengan analisis secara kualitatif bobot kromosom kunyit lebih dari 10000bp.
M

>10000 bp
>10000 bp

10000 bp
3500 bp

700 bp
500 bp
250 bp
Gambar 1 Elektroforegram isolasi plasmid PGEMT dari E.coli DH5. Lajur M=
marka DNA 1 kb, lajur 1= meja 1, lajur 2= meja 2, lajur 3= meja 3, lajur
4= meja 4, lajur 5= meja 5, lajur 6= meja 6

>10000 bp

1
M

>10000 bp
10000 bp

1000 bp
500 bp
250 bp
Gambar 2 Elektroforegram isolasi kromosom daun kunyit (lajur 1 sampai 4) dan
jahe (lajur 5 sampai 8). Lajur 1= meja 1, lajur 2= meja 2, lajur 3= meja
3, lajur 4= meja 4, lajur 5= menja 5, lajur 6= meja 6, lajur 7= meja 7-1,
lajur 8= meja 7-2, lajur M= marka DNA 1 kb
Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs
tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim
restriksi adalah enzim yang bekerja untuk memotong fragmen DNA pada situs
spesifik. Seperti diketahui, di dalam Bioteknologi terdapat dua kategori enzim yang
berperan dalam proses rekombinasi DNA, yaitu enzim yang berperan dalam isolasi
DNA dan penyiapan DNA rekombinan (di mana dua molekul 2 DNA
dikombinasikan). DNA spesifik atau gen diisolasi/diambil dari DNA dengan
memotong sugar phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber
yang berbeda dicampur dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat
dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu: enzim restriksi
endonuklease yang berperan sebagai gunting untuk memotong DNA pada situs
spesifik dan DNA ligase yang berperan sebagai lem yang merekatkan dua molekul
DNA di dalam tabung reaksi. Restriksi endonuklase memotong sugar phosphat
backbone DNA pada kedua utasnya (Artama 1991).
Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalam molekul DNA.
Urutan yang spesifik tersebut pada umumnya terdiri dari 4 6 pasang basa dan
bersifat palindromik (palindrom). Palindrom merupakan daerah yang memiliki
urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah yang sama
yaitu 5 3. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya
di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA
double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu
deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan
dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung
kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul
dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang
tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul
DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5 atau 3)

10

K+ 5

10000 bp

1000 bp

750 bp

750 bp
500 bp

250 bp

250 bp

Gambar 3 Elektroforegram digesti plasmid PJEMT Easy dengan KpnI (lajur 1

sampai 4) dan EcoRI (lajur 5 sampai 8). Lajur 1= meja 1, lajur 2= meja 2, lajur 3=
meja 3, lajur 4= meja 4, lajur K+= kontrol positif, lajur 5= meja 5, lajur 6= meja 6,
lajur 7= meja 7-1, lajur 8= meja 7-2
menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini
dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut
sticky (mudah lengket) atau kohesif (Artama 1991). Gambar 3 menunjukkan hasil
elektroforesis DNA plasmid yang telah dipotong menggunakan enzim retriksi KpnI.
Hasil ini menunjukkan tidak terjadi pemotongan pada DNA plasmid yang di potong
dengan KpnI. Hal ini seuai denan literatur yang menunjukkan bahwa tidak ada situs
pemotongan KpnI pada plasmid pGEMT Easy (Gambar 3) (Promega 2015).

Gambar 3 Plasmid pGEMT Easy (Promega 2015)

11
DNA adalah sesuatu yang tidak terlihat di dalam gel, sehingga perlu
penambahan Ethidium Bromida yang pada umumnya digunakan untuk membuat
pita DNA terlihat. Molekul Ethidium Bromida berinterkalasi di antara basa
menyebabkan DNA berfluorosescens ketika gel dieluminasi dengan sinar
ultraviolet akan tetapi proses tersebut akan sulit apabila proses destaining tidak
dilakukan. Proses destaining ini dilakukan setelah proses staining yaitu dengan
membilas gel agarose dengan akuades. Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan
Etidium bromida yang terperangkap di dalam gel sehingga ketika dieluminasi oleh
sinar UV hanya pita DNA yang terlihat karena DNA berikatan dengan Etidium
Bromida melalui ikatan hidrohen (Artama 1991).
Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara
untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. DNA dapat
dilihat secara langsung dan dapat ditentukan ukurannya berdasarkan migrasinya
pada gel agarose maupun gel poliakrilamid. Migrasi DNA dalam gel disebut
sebagai elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang terdapat di
gel diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr), kemudian dilihat di atas sinar ultra
violet. Ethidium bromida dapat menangkap sinar ultra violet sehingga pendaran
sinar UV ini dapat terlihat. Ethidium mengikat molekul DNA, sehingga molekul
DNA dapat terlihat ketika dilihat di atas sinar ultra violet. DNA merupakan molekul
bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan dalam medan listrik, DNA akan
bermigrasi dari kutub negatif ke kutub positif. Faktor penentu laju elektroforesis
DNA, yaitu ukuran molekul DNA; prosentase/kerapatan gel yang dilalui DNA; arus
listrik yang diberikan untuk memigrasikan molekul DNA (Artama 1991).
Semakin kecil ukurannya DNA akan semakin cepat migrasi DNA. Semakin
rapat media yang digunakan, semakin tinggi prosentasenya, maka semakin lambat
DNA bermigrasi. Semakin besar arus yang diberikan, maka semakin cepat DNA
bermigrasi. Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul
menggunakan kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan
molekul dengan menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil
keuntungan bahwa, sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika
diletakkan di dalam medan listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda)
dan menjauhi kutub negatif (katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi
DNA terlebih dahulu harus ditambahkan loading buffer (dye) yang memiliki fungsi,
yaitu menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar well; pewarna
untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam well; agar dapat bergerak
ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan
sebagai tanda migrasi DNA (Artama 1991).

PENUTUP
Simpulan
Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa DNA plasmid pGEMT Easy dari
E.coli memiliki ukuran lebih dari 10000 bp dan ukuran DNA kromosom kunyit
lebih dari 1000bp. Hasil elektrogram retriksi plasmid menunjukkan tida terjadinya

12

pemotongan pada plasmid oleh enzim KpnI. Hal ini disebabkan tidak adanya situs
pemotongan enzim tersebut pada plasmid.

DAFTAR PUSTAKA
Artama WT. 1991. Rekayasa Genetika. Yogyakarta (ID): Pusat Antar Universitas
Bioteknologi UGM.
Fatih M. 2009. Isolasi dan digesti DNA kromosom. Jurnal Penelitian Sains &
Teknologi. 10(1): 61-67.
Firth HV, Hurst JA. 2005. Oxford desk Reference Clinical Genetics. New York
(US): Oxford University Press.
Kotchoni SO, Gachomo EW, Betiku E, Shonukan, Olusola O. 2003. A Home Made
Kit for Plasmid DNA Mini-Preparation. African Journal of Biotechnology.
2(4): 88-90.
Passarge E. 2007. Color Atlas of Genetics 3rd Edition. New York (US): Theme
Stuttgart.
Promega. 2015. pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System. [terhubung berkala]
https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technicalmanuals/0/pgem-t-and-pgem-t-easy-vector-systems-protocol.pdf pada 10
November 2016.
Royston C, Clowes. 1972. Molecular Structur of Bacterial Plasmids. New York
(US): Hill Company Inc.