ISOLASI PLASMID SEBAGAI VEKTOR KLONING Ga

(SL 16)

TRINOVIYANI
F251180111

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2019
 1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Plasmid adalah istilah yang diberikan pada salah satu vektor pembawa
molekul DNA di dalam proses rekayasa genetika melalui teknologi DNA
rekombinan. Penggunaan plasmid banyak dimanfaatkan untuk pengklonan DNA,
karena mudah dalam penanganannya. Definisi lain dari plasmid yaitu molekul DNA
utas ganda yang tidak memiliki ujung dan berukuran kecil yang terdapat di dalam
sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan
Widyastuti 2006). Plasmid yang terdapat pada bakteri memiliki kemampuan untuk
bereplikasi sendiri dengan tidak bergantung pada kromosom bakteri dan dapat
diturunkan pada anakan. Plasmid yang terbentuk secara alami dapat meningkatkan
penyebaran berbagai sifat dari suatu mikroorganisme misalnya resistensi obat,
virulensi, dan metabolisme zat langka (Johnson dan Nolan 2009).
Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,
dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi dan menghasilkan pelet sel yang
mengandung DNA/RNA total. Prinsip isolasi tersebut sama halnya dengan prinsip
isolasi DNA plasmid. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu isolasi sel;
lisis dinding dan membran sel; ekstraksi dalam larutan; purifikasi; dan presipitasi
(Faatih 2012). Menurut Ferrûs et al. (1999) Ekstraksi plasmid juga memiliki tiga
tahap utama diantaranya lisis sel bakteri, pelepasan DNA plasmid selektif dari
matriks sel, dan penghilangan kontaminan untuk mendapatkan DNA plasmid yang
murni. Prosedur yang dilakukan dengan benar akan memperoleh DNA kromosom
dan plasmid dengan kemurniannya cukup tinggi dengan analisis secara kualitatif
dan kuantitatif.
Kualifikasi dan kuantifikasi DNA dilakukan untuk mengetahui baik tidaknya
DNA hasil isolasi. Saunders & Parkers (1999) mengemukakan bahwa ada tiga
kriteria yang penting untuk menentukan baik tidaknya DNA hasil isolasi, yaitu
konsentrasi, kemurnian dan integritas. Konsentrasi DNA yang baik menunjukkan
kecukupan jumlah DNA untuk digunakan dalam analisis lanjutan. Kualitas DNA
dapat diamati melalui pembacaan pita DNA di dalam gel elektroforesis. Hasil yang
baik diindikasikan dengan pita DNA yang tebal dan tegas serta bersih. Kualitas
DNA yang berhubungan dengan kemurniannya terhadap kontaminan protein dapat
diamati melalui pengukuran nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan
280 nm (Suharsono dan Widyastuti 2006).

Tujuan Penelitian

Praktikum ini bertujuan untuk mengisolasi DNA plasmid sebagai vektor

kloning Ga (SL 16) pada kultur Escherichia coli, serta melihat kualitas dan
kuantitas DNA yang diperoleh menggunakan metode elektroforesis dan
spektrofotometri.
2

2 METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum isolasi plasmid dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar

Universitas, IPB University, dari tanggal 20 Agustus hingga 29 Agustus 2019 pukul
11.00-16.00 WIB.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi plasmid adalah tabung mikro
steril 1.5 mL, micropippete (100 µL, 200 µL, dan 1000 µL), tip steril, vortex mixer,
sentrifus, oven, microwave, freezer, set alat elektroforesis dan spektrofotometer.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi plasmid adalah kultur
bakteri Escherichia coli DH5α yang mengandung plasmid PGEM-Teasy, solution
I, solution II, solution III, larutan PCI (phenol:chlorofom:isopropanol), EtOH 100%
etanol 70%, ddH2O, RNAse dan es batu.

Prosedur

Isolasi Plasmid
Praktikum isolasi plasmid dilakukan dengan prosedur sebagai berikut; alat
dan bahan yang akan digunakan terlebih dahulu disiapkan. Kultur Escherichia coli
yang mengandung plasmid PGEM-Teasy diambil sebanyak 1,5 mL atau sekitar
1500 µL menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam tube baru (steril), tube
hasil pemindahan selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 5000 rpm, selama 5
menit pada suhu 20oC, dari hasil sentrifuse diperoleh dua fase yaitu pellet,
kumpulan bahan genetik yang mengendap di dasar tube, dan supernatant berupa
larutan. Selanjutnya supernatan dibuang pada wadah yang telah disediakan dan
pellet disisakan, pellet kemudian ditambahkan dengan solution buffer I/buffer
suspensi (Tris HCl pH 7.5 + EDTA) sebanyak 100 µL kemudian divortex.
Selanjutnya tube ditambahkan dengan solution buffer II/buffer lisis (0.2M NaOH,
1% SDS) sebanyak 200 µL, kemudian tube dibolak-balik selama ± 10 kali, tube
yang telah dibolak-balik kemudian disimpan di dalam es selama 5 menit, setelah itu
ditabahkan dengan solution buffer III/buffer netralisasi (1.32 M Na-asetat pH 4.8)
sebanyak 150 µL, kemudian tube dibolak-balik selama ± 10 kali, tube kembali
disimpan di dalam es selama 10 menit kemudian dimasukkan ke sentrifuse untuk
dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu
20oC. Proses sentrifugasi akan mengendapkan dan menghasilkan supernatant ± 350
µL, supernatant kemudian dipindahkan ke tube baru, dan ditambahkan P:C:I
(Phenol Cloroform Isoamil Alcohol) sebanyak 1 kali dari volume sampel, tube
dihomogenkan menggunakan vortex, lalu disentrifuse dengan kecepatan 10.000
rpm, selama 10 menit pada suhu 20oC, hasil dari sentrifugasi ini menghasilkan dua
bagian yang terpisah, fase atas yang mengandung DNA plasmid ditambahkan EtOH
100% sebanyak 1000 µl dan dibolak-balik perlahan.
 3

DNA plasmid selanjutnya disimpan pada freezer overnight, kemudian

disentrifugasi 10000 rpm, 4°C selama 25 menit. Pelet yang diperoleh ditambahkan
500 µl EtOH 70% dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10000 rpm, selama
5 menit pada suhu 4°C. Pelet DNA plasmid yang diperoleh kemudian dikeringkan
dalam oven 60°C selama 20-25 menit. Kemudian ditambahkan 15-20 µl dH2O dan
RNAse sebanyak 0.2 x volume (1 mg/mL). Setelah itu diinkubasi pada suhu 37°C
selama 10 menit. DNA plasmid yang berhasil diisolasi kemudian dianalisis
kemurnian secara kualitatif dan konsentrasi secara kuantitatif dengan elektroforesis
dan spektrofotometer.

Pembuatan Agarose Elektroforesis

Sebelum analisis kualitatif dengan elektroforesis, sebelumnya dibuat gel
agarose dengan mensuspensikan 1% atau 0.35 gram agarose ke dalam buffer TAE
1x (Tris-HCl pH 8.3 40 mM, asam asetat pekat 1.98 mM, EDTA 1 mM) 35 mL,
larutan agar dipanaskan pada microwave 100oC hingga jernih selama 2 kali 1 menit.
Setelah suhu gel agarose mulai dingin, gel dituangkan ke dalam gel tray (cetakan
gel) dan dipasang sisir untuk membuat sumuran. Setelah gel mengeras, sisir dilepas
kemudian gel dipindah ke dalam electroforesis chamber yang sudah diisi dengan
buffer TAE.

Kualifikasi DNA Plasmid dengan Elektroforesis

Kualifikasi DNA plasmid dilakukan dengan mencampurkan sebanyak 5 µl
DNA plasmid dengan 1 µl larutan loading dye. Sampel DNA tersebut serta penanda
kuantitas (marker λ) dipipet sebanyak 6 µl kedalam masing-masing sumur pada gel
agarosa. Selanjutnya alat elekroforesis dirunning dengan set tegangan 100 volt
selama 28 menit (DNA bergerak dari muatan negatif ke positif). Gel yang telah
dirunning selanjutnya direndam dalam larutan ETBR (Etidium Bromide) selama 10
menit. gel dibilas dengan akuades dan hasil elektroforesis diamati dibawah
GelDoc/Transluminator. Jumlah DNA plasmid dianalisis dengan membandingkan
antara pendaran pita DNA plasmid yang dianalisis dengan pendaran pita DNA
penanda (marker λ). Jumlah pita di dalam gel dilihat sebagai bentuk DNA plasmid.

Kuantifikasi DNA Plasmid dengan Spektrofotometer

Sebanyak Suspensi 3 µl DNA plasmid ditambahkan dengan 697 µl ddH2O.
Suspensi DNA plasmid kemudian dimasukkan kedalamm kuvet dan dibaca
absorbansinya menggunakan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 260
nm dan 280 nm. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dikonversikan
ke dalam konsentrasi, yaitu 1 OD260 = 50 µg/ml. Kemurnian DNA diketahui melalui
nilai absorbansi 260 nm dibandingkan dengan nilai absorbansi 280 nm, DNA
dianggap murni apabila tingkat kemurniannya berada diantara 1.8 – 2.0. rumus
yang digunakan untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian DNA dapat dilihat
pada persamaan 1 dan 2.
g
Konsentrasi DNA =Abs. λ 260×50 µg/mL ml ×faktor pengenceran (1)
Abs.λ 260
Kemurnian DNA= (2)
Abs.λ 280
4

3 HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis Elektroforesis

Praktikum isolasi plasmid kultur Escherichia coli yang mengandung plasmid

PGEM-Teasy memperlihatkan hasil yang signifikan dengan ditandai oleh adanya
pola pita DNA yang muncul pada saat pandaran cahaya UV transilluminator yang
dapat diamati pada gambar 1.

1
2

Gambar 1 Hasil kualifikasi isolasi plasmid menggunakan UV

transilluminator

Gambar 1 menunjukkan sumur pembanding 1 (M1) dan 2 (M2) yaitu λ1 dan

λ2 (lambda/ ladder) dengan ketebalan berturut-turut berkisar 300 ng dan 100 ng.
Visualisasi yang ditunjukkan pada uji kualitatif isolasi plasmid menggunakan UV
transilluminator menunjukkan hasil yang positif. Sampel kelompok 7 memiliki 3
pita DNA yang ditunjukkan pada angka nomor 1, 2, dan 3. Posisi pita pada gambar
1 menunjukkan ukuran yang berbeda-beda, pita paling atas merupakan DNA
dengan kandungan pasang basa yang paling besar, dan diikuti oleh pita berikutnya.
Pita 2 dan 3 diperkirakan sebagai DNA plasmid yang menjadi target isolasi
sedangkan pita 1 diduga sebagai DNA kromosom dengan ukuran yang lebih besar.
Hal ini didukung oleh pernyataan Khusnuryani et al (2016) bahwa apabila hasil
isolasi DNAnya murni maka akan muncul satu atau dua band. Edvotek (2016) juga
mengemukakan bahwa umumnya plasmid mengandung 1000 sampai 10000 pasang
basa (bp), dan plasmid terbesar pun lebih kecil daripada DNA kromosom bakteri
yang mengandung pasang basa sekitar 1000000 bp. Ukuran pita terkecil berada
pada posisi paling bawah yang kemungkinan adalah bentuk supercoil atau nicked.
Menurut Wheeler et al (1992) bahwa beberapa bentuk DNA baik berupa sirkuler
dan linier, sirkular dan nicked-sirkuler dan berbagai topoisomer DNA melingkar
tertutup dapat dibedakan berdasarkan jarak migrasinya pada gel agarosa
elektroforesis. Tebal atau tipisnya pita dapat dipengaruhi oleh banyak faktor,
diantaranya adalah konsentrasi DNA yang digunakan untuk elektroforesis, kualitas
 5

pewarna DNA, serta buffer yang digunakan sebagai fase gerak dalam elektroforesis
(Khusnuryani et al 2016).

Analisis Spektrofotometri

Kuantitas DNA plasmid yang diisolasi diketahui dengan pengukuran

menggunakan spektofotometer yang ditunjukkan pada Tabel 1. Serapan diukur
dengan menggunakan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pita ganda DNA
dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol
dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Adanya perbedaan penyerapan cahaya UV
dapat mengukur kemurnian DNA dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm
dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280). Hasil pengukuran DNA plasmid
dengan spektrofotometer yang diperoleh oleh kelompok 7 menunjukkan kemurnian
yang baik dengan nilai rasio Å260/Å280 adalah 1.880. Hal ini sesuai dengan
pernyataan Khusnuryani et al. (2016) bahwa DNA dikarakterisasikan murni dengan
perbandingan A260/280 pada kisaran 1,8-2,0.

Tabel 1 Hasil kuantitatif isolasi plasmid dengan spektrofotometer

Sampel Panjang Gelombang Kemurnian Konsentrasi
λ 260 λ 280 DNA
1 1.194 0.627 1.904 13930
2 1.026 0.554 1.851 11970
3 1.133 0.597 1.897 13218
4 0.961 0.517 1.858 11211
5 1.366 0.752 1.816 15936
6 0.520 0.285 1.824 6066
7 0.944 0.502 1.880 11013
8 0.931 0.499 1.865 10861
Rata-rata 1.180 0.542 1.862 11776

4 KESIMPULAN

Praktikum isolasi plasmid pada bakteri E.coli sebagai vektor kloning Gα

(SL16 ) kelompok 7 memperlihatkan hasil yang positif dengan tingkat kemurnian
yang baik. Analisis secara kualitatif dengan elektroforesis menunjukkan
keberhasilan isolasi dengan munculnya pita DNA. Selain itu analisis kuantitatif
dengan spektrfotometer menghasilkan range nilai absorbansi yang sesuai dengan
karakteristik kemurnian DNA yang diharapkan.
6

DAFTAR PUSTAKA

Edvotek 2016. Mini-prep Isolation of Plasmid DNA. The Biotechnology Education

Company.
Faatih M. 2012. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurusan Pendidikan Biologi
FKIP. Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Ferrûs MA, Alonso JL, Amoros I, Hernândez M, Hernândez J. 1999. A rapid
procedure for the isolation of plasmid DNA from environmental bacteria. Int.
Microbiol. 2(2):115–117.
Johnson TJ, Nolan LK. 2009. Pathogenomics of the virulence plasmids of
Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73(4):750–74.
Khusnuryani A, Solihah J, Muallifah AY. 2016. Isolasi dan Analisis Kualitas DNA
Plasmid (pGEM®-3Zf(+))) sebagai Sediaan Kebutuhan Praktikum di
Laboratorium Biologi Fakultas Sains dan Teknologi. Integr. Lab J.:63–70.
Saunders, Ginny C, Parkers, and Helen C. 1999. Analytical molecular biology:
Quality and validation. Laboratory of the Government Chemis. Teddinton.
UK.
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,
IPB.
Wheeler D, Lin JH, Chrambach A. 1992. Distinction between supercoiled and
linear DNA in transverse agarose pore gradient gel electrophoresis.
Laboratory of Theoretical and Physical Biology, National Institute of Child
Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda.