MODUL 2 BIS2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM.

GENAP

ISOLASI PLASMID

I. LATAR BELAKANG

Plasmid adalah materi genetik yang merupakan extrachromosomal DNA yang berupa
DNA sirkuler dan beruntai ganda. Plasmid umumya terdapat pada bakteri dan berukuran
lebih kecil dari kromosom. Organisme lain yang diketahui memiliki plasmid selain bakteri
hanyalah Saccharomyces cerevisiae. Gen-gen yang ada pada plasmid umumnya adalah
gen-gen yang non-esensial bagi bakteri. Plasmid memiliki alat replikasi sendiri dan
umumnya membawa satu atau lebih gen yang umumnya bertanggung jawab pada
karakteristik tertentu bagi sel. Contohnya, kemampuan suatu bakteri hidup pada
konsentrasi toksik antibiotik seperti ampisilin atau klorampenikol.

Semua plasmid memiliki setidak-tidaknya satu urutan DNA yang berperan sebagai origin of
replication, sehingga plasmid dapat bermultiplikasi dalam sel secara independen, tidak
bergantung pada kromosom, walaupun ada beberapa plasmid yang mampu berintegrasi ke
dalam kromosom. Plasmid bervariasi dalam ukuran dan jumlahnya (copy number)
bergantung pada jenis bakteri yang memiliki plasmid tersebut. Copy number adalah
jumlah molekul plasmid yang secara normal terdapat pada satu sel bakteri.

Pada teknologi DNA rekombinan peran plasmid sangat penting sebagai vektor atau
pembawa gen pada proses kloning. Plasmid yang digunakan pada teknologi DNA
rekombinan selain memiliki origin of replication (ori), juga memiliki urutan DNA tertentu
yang merupakan urutan DNA yang dikenali oleh enzim-enzim restriksi tertentu yang
disebut sebagai multiple cloning site (MCS). MCS adalah tempat menyisipkan DNA atau
gen. Selain kedua urutan DNA tersebut, plasmid juga memiliki gen penanda yang
umumnya berupa gen pengkode resisten antibiotik. Gen penanda tersebut berfungsi pada
saat seleksi atau untuk meyakinkan bahwa bakteri pembawa plasmid tersebut tumbuh
pada media seleksi.

Secara umum, pada teknologi DNA rekombinan dikenal dua jenis plasmid; plasmid kloning
(cloning vector atau cloning plasmid) dan plasmid ekspresi (expression vector atau
expression plasmid). Plasmid kloning berfungsi hanya sebagai pembawa gen asing tapi
tidak memiliki perangkat untuk mengekspresikan gen sisipan tersebut menjadi protein.
Plasmid ekspresi dapat berfungsi sebagai plasmid kloning sekaligus dapat
mengekspresikan gen sisipan, karena memiliki perangkat untuk ekspresi gen.

Isolasi dan pemurnian plasmid merupakan bagian yang penting dalam biologi molekuler
dan teknologi DNA rekombinan. Isolasi dan pemurnian plasmid umumnya dilakukan
dengan metode lisis alkali, tapi saat ini isolasi dan pemurnian plasmid menggunakan kit
sudah sangat populer. Pada percobaan ini anda akan melakukan isolasi dan pemurnian
plasmid menggunakan kit PureyieldTM Plasmid Miniprep System dari Promega. Anda dapat
membaca lebih lengkap mengenai kit tersebut pada website Promega
www.promega.com/tbs.

Proses isolasi plasmid melibatkan tahap-tahap yang sama dengan proses isolasi
kromosom, tetapi pada proses isolasi plasmid diperlukan suatu tahap pemisahan plasmid

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 1

MODUL 2 BIS2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

dari kromosom. Prinsip pemisahan ini berdasarkan perbedaan fisik dari plasmid dan
kromosom. Plasmid berukuran jauh lebih kecil dari kromosom dan plasmid berada dalam
konformasi supercoiled sedangkan DNA kromosom adalah non-supercoiled. Konformasi
supercoiled dapat dipertahankan hanya jika untai polinukleotida berada dalam keadaan
utuh, karenanya disebut sebagai covalently closed-circular (ccc). Jika salah satu untai
polinukleotida rusak, untai ganda akan kembali ke keadaan normalnya, dan plasmid akan
berada dalam konformasi alternatif yang dikenal sebagai open-circular (Gambar 1).

(a) Supercoiled (b) Open-circular (c) Linier

Gambar 1. Konformasi DNA untai ganda sirkuler

(a) Supercoiled; kedua untai utuh, (b) Open-circular; satu atau kedua untai nick, (c) linier

(Brown T.A., 2010, Gene Cloning & DNA Analysis: An Introduction 6th ed)

Pada percobaan ini metode yang digunakan untuk memisahkan DNA supercoiled (plasmid)
dan DNA non-supercoiled (kromosom) adalah metode lisis alkali. Dasar dari metode ini
adalah bahwa pada rentang pH yang sempit (pH 12 – 12,5), DNA non-supercoiled
(kromosom) akan terdenaturasi, sementara DNA supercoiled (plasmid) tidak. Pada saat
NaOH ditambahkan pada ekstrak sel, maka pH akan berubah menjadi 12 – 12,5, dan
ikatan hidrogen DNA non-supercoiled akan terputus dan DNA untai ganda terpisah. Jika
ditambahkan asam, maka akan terjadi proses penetralan dan untai DNA yang
terdenaturasi akan mengalamai agregasi kembali dalam bentuk seperti benang kusut yang
tidak larut. DNA kromosom yang terdenaturasi tersebut dapat dipisahkan dari plasmid
dengan sentrifugasi (Gambar 2.)

Gambar 2. Isolasi dan pemurnian plasmid dengan metode lisis alkali

(Brown T.A. 2010. Gene Cloning & DNA Analysis: An Introduction, 6th ed)

Plasmid dapat berada dalam 3 jenis konformasi; supercoiled, open-circular (oc), dan linier
Plasmid supercoiled sering disebut sebagai covalently closed circular DNA, ccc. Di dalam
sel (in vivo), DNA plasmid berada dalam konformasi supercoiled untuk menyesuaikan
bentuk agar dapat berada di dalam sel.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 2

MODUL 2 BIS2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

Pada elektroforesis DNA gel agarosa ketiga konformasi tersebut bermigrasi secara
terpisah (Gambar 3). Konformasi supercoiled akan bergerak paling cepat dan konformasi
open circular (nicked) akan bergerak paling lambat.

Open circular (nicked)

linier

supercoiled

Gambar 3. Perbedaan migrasi plasmid pada elektroforesis DNA berdasarkan konformasinya

Ukuran suatu DNA plasmid dapat ditentukan melalui elektroforesis DNA gel agarosa,
hanya jika plasmid sudah dipotong dengan enzim restriksi sehingga berbentuk linier.
Ukuran ditentukan dengan membandingkannya terhadap marka DNA yang telah diketahui
ukurannya.

II. TUJUAN
Melakukan isolasi dan pemurnian plasmid dari bakteri E. coli rekombinan.

III. ALAT DAN BAHAN

1. Kit PureYield™ Plasmid Miniprep System dari Promega.
2. Mikrosentrifuga
3. Tabung mikrosentrifuga
4. Mikropipet dan tip
5. Kultur sel E. coli rekombinan
6. Es

III. PROSEDUR

Pada percobaan ini dilakukan isolasi plasmid menggunkanan kit PureYield™ Plasmid
Miniprep System dari Promega.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 3

MODUL 2 BIS2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

DNA Plasmid Purification by Centrifugation

Prepare Lysate
1. Centrifuge 1.5 ml of bacterial culture for 1 minute
at 14.000 rpm in a microcentrifuge. Discard the
supernatant.
2. Add 600 μl of TE buffer or sterilized water to the
cell pellet, and resuspend completely.
3. Add 100 μl of Cell Lysis Buffer (Blue), and mix by
inverting the tube 6 times.
4. Add 350 μl of cold (4–8°C) Neutralization
Solution, and mix thoroughly by inverting the tube.
5. Centrifuge at 14.000 rpm in a microcentrifuge for
3 minutes.
6. Transfer the supernatant (~900 μl) to a PureYield™
Minicolumn without disturbing the cell debris pellet.
7. Place the minicolumn into a Collection Tube, and
centrifuge at 14.000 rpm in a microcentrifuge for
15 seconds.
8. Discard the flowthrough, and place the minicolumn
into the same Collection Tube.

Wash
9. Add 200 μl of Endotoxin Removal Wash (ERB) to
the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a
microcentrifuge for 15 seconds.
10. Add 400 μl of Column Wash Solution (CWC) to
the minicolumn. Centrifuge at maximum speed in a
microcentrifuge for 30 seconds.

Elute
11. Transfer the minicolumn to a clean 1.5 ml
microcentrifuge tube, then add 50 μl of Elution
Buffer or nuclease-free water directly to the
minicolumn matrix. Let stand for 1 minute at room
temperature.
12. Centrifuge for 30 seconds to elute the plasmid
DNA. Cap the microcentrifuge tube, and store
eluted plasmid DNA at –20°C.

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 4

MODUL 2 BIS2204_PRAKTIKUM GENETIKA DAN BIOLOGI MOLEKULER SEM. GENAP

REFERENSI
1. Brown T.A., 2010, Gene Cloning & DNA Analysis: An Introduction, 6th ed., Wiley-
Blackwell, UK.
2. Sambrook, 2001, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed Vol.1-3, Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
3.Technical Manual PureyieldTM Plasmid Miniprep System, Promega

RFK-INSTITUT TEKNOLOGI DEL 5