Kelompok 5B Indralaya:

1. Adi Hermawan (06101182025006)

2. Devy Dwy Agustin (06101382025050)
3. Jihan Audira (06101282025042)
4. Via Aprilia (06101182025002)

PERTEMUAN 13

KLONING GEN
1. Orientasi

Berdasarkan materi dan video pembelajaran pertemuan ke dua belas biokimia 1 pada pokok
bahasan cloning gen yang telah disajikan, kemudian analisislah mengapa ada cloning gen? Untuk
kepentingan apa melakukan cloning gen? Berbahayakah melakukan cloning gen?
Jawab:

Link YouTube: https://youtu.be/eqkriLGINxA

Kloning berasal dari Bahasa Yunani yaitu clone atau klon yang artinya kumpulan sel turunan dari
sel induk tunggal dengan reproduksi aseksual.Teknologi kloning mengarah kepada kemajuan
dunia kedokteran, serta bermanfaat untuk pengembangan ilmu pengetahuan, diagnostik dan
terapi.Namun, kloning juga dapat berdampak negatif yaitu dapat disalahgunakan untuk
menciptakan spesies atau ras baru dengan tujuan tertentu yang bertentangan dengan nilai
kemanusiaan. Kekacauan dalam kekerabatan dan identitas diri dari hasil kloning maupun induknya
dapat saja terjadi.

Beberapa ilmuwan yang mendukung, berpendapat bahwa kloning adalah salah satu cara yang
mungkin untuk melestarikan spesies yang punah.Namun disisi lain, banyak yang tidak mendukung
karena berpotensi tidak aman dan tidak etis, terutama untuk diterapkan kepada manusia.

Kloning gen terdiri dari tiga macam, di antaranya:

1. Kloning pada hewan

Proses reproduksi organisme diambil dari sel organisme induk sehingga menghasilkan keturunan
yang secara genetik identik.Ini berarti hewan kloning merupakan duplikat sama persis dari
induknya, yang berarti juga memiliki DNA yang sama. Kloning tersebut banyak terjadi di alam.
Reproduksi aseksual pada organisme tertentu dan terjadinya kembar dari sel telur yang sama
merupakan contoh kloning. Dengan kemajuan teknologi, proses kloning saat ini bisa dilakukan di
laboratorium.
2. Kloning pada tumbuhan

Kloning pada tumbuhan yaitu mencangkok atau menyetek tanaman untuk mendapatkan tanaman
yang memiliki sifat persis dengan induknya.

3. Kloning pada manusia

Kloning terhadap manusia sudah banyak menimbulkan kontroversi sejak beberapa tahun lalu
hingga sekarang. Pemimpin agama negara menyatakan bahwa kloning tidak etis untuk diterapkan
kepada manusia

Dampak Positif dan Negatif dari Kloning

Kloning sebenarnya memiliki dampak positif dan dampak negatif sebagai berikut.
Dampak positif

- Kloning menjadi pilihan untuk menyelamatkan genetic yang hilang dari hewan yang mati
secara teratur.

- Resipien transfer embrio tidak dibatasi waktu dan tempat.

- Embrio dapat disimpan dengan waktu yang lama.

Dampak negatif

- Keterbatasan resipien menerima embrio

- Jika tidak ada recording terhadap penggunaan, embrio dapat menjadi inbreeding pada
keturunan.

- Muncul pewarisan sifat mitokondria dan modifikasi epigenetik yang tidak diharapkan dan
disebabkan oleh prosedur kloning.

2. PENCETUSAN IDE
Pahamilah orientasi di atas yang telah disajikan, setelah saudara diskusikan mengenai doning gen,
bahasiah: Bagaimana proses cloning gen? Apa syarat-syarat kloning gen? apakah boleh di
Indonesia melakukan kloning gen? Bahaslah bersama kelompok pada Lembar Kerja Mahasiswa
(LKM) yang telah disediakan.
Jawaban:

Adapun bahan-bahan dasar (utama) yang digunakan dalam proses cloning adalah sebagai
berikut:
 1. Fragmen DNA, adalah gen target yang akan dikloning.
2. Vektor, adalah molekul DNA untai ganda, melingkar atau linier yang dapat
menghasilkan molekul DNA rekombinan dalam proses kloning. Vektor mampu membawa gen
target ke dalam sel inang melalui proses transformasi.

3. Sel inang, adalah sel hidup yang mampu ditumpangi oleh vector asli atau rekombinan.
Sel inang dapat berupa organisme uniselular (bersel tunggal) seperti bakteri, maupun multiselular
(bersel banyak) seperti jamur, tumbuhan, hewan hingga manusia. Sel inang mampu
memperbanyak vektor, menghasilkan banyak salinan identik, tidak hanya dari dirinya sendiri
tetapi juga dari gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, salinan molekul DNA
rekombinan diteruskan keketurunan dan replikasi vektor lebih lanjut terjadi. Setelah sel inang
melakukan pembelahan sel, koloni, atau klon yang diproduksi, maka setiap sel dalam klon berisi
satu atau lebih salinan molekul DNA rekombinan, gen yang dibawa oleh molekul rekombinan
sekarang dikatakan telah dikloning.
4. Enzim restriksi endonuklease, dan enzim ligase. Enzim restriksi endonuklease adalah
enzim yang diperlukan untuk memotong untai DNA yang di inginkan, sedangkan enzim ligase
digunakan untuk meligasi DNA sehingga memperoleh DNA rekombinan.

. LANGKAH LANGKAH DALAM KLONING GEN

1) Persiapan DNA sel total

Langkah pertama dalam proses cloning gen adalah persiapan DNA yang diinginkan atau
fragmen DNA target. Persiapan DNA target dilakukan dengan mempertimbangkan jenis prosedur
pemurnian DNA yang paling sederhana, di mana seluruh komplemen DNA dari sel bakteri
diperlukan. Prosedur preparasi DNA total dari kultur sel bakteri dapat dibagi menjadi empat tahap
(Gambar 101):

1. Kultur bakteri ditumbuhkan dan kemudian dipanen.

2. Sel-sel dipecah untuk mendapatkan DNAnya.

3. Ekstrak sel ini diperlakukan pemurnian untuk menghilangkan semua komponen kecuali
DNA.
4. Larutan DNA yang dihasilkan terkonsentrasi.
 2) Persiapan DNA Plasmid
Pemurnian plasmid dari kultur bakteri melibatkan strategi umum yang sama seperti
preparasi DNA sel total. Kultur sel, yang mengandung piasmid, ditumbuhkan dalam medium cair,
dipanen, dan ekstrak sel disiapkan. Protein dan RNA dihilangkan, dan DNA mungkin
terkonsentrasi oleh pengendapan etanol. Namun, ada perbedaan penting antara pemumian plasmid
dan persiapan DNA sel total. Dalam preparasi plasmid selalu periu untuk memisahkan DNA
plasmid dari sejumlah besar DNA kromosom bakteri yang juga ada di dalam sel. Memisahkan
kedua jenis DNA ini bisa sangat sulit, tetapi tetap penting jika plasmid akan digunakan sebagai
vektor kloning. Kehadiran jumlah terkecil DNA bakteri yang mencemari dalam percobaan kloning
gen dapat dengan mudah menyebabkan hasil yang tidak diinginkan. Untungnya beberapa metode
tersedia untuk menghilangkan DNA bakteri selama pemurnian plasmid, dan penggunaan metode
ini, secara individu atau kombinasi, dapat menghasilkan isolasi DNA plasmid yang sangat murni.
Plasmid dan kromosom bakteri berbentuk sirkular, tetapi selama preparasi ekstrak sel, kromosom
selalu dipecah untuk menghasiikan fragmen-fragmen linier. Oleh karena itu, metode untuk
memisahkan molekul melingkar dari molekul linier akan menghasilkan plasmid murni.
Sentrifugasi gradien kerapatan etidium bromida-cesium klorida. Ini adalah versi khusus
dari teknik kesetimbangan atau sentrifugasi gradien densitas yang lebih umum. Gradien densitas
dihasilkan dengan cara mensentrifugasi larutan, protein mengapung di atas gradien dan pelet RNA
di bagian bawah. Posisi pita DNA dapat ditihat dengan menyinari radiasi ultraviolet pada tabung,
yang menyebabkan ikatan EtBr berfluoresensi. DNA plasmid murni diambil dengan menusuk sisi
tabung dan mengambil sampel dengan jarum suntik. EtBr yang terikat pada DNA plasmid
diekstraksi dengan n butanol dan CsCI dihilangkan dengan dialisis. Plasmid yang dihasilkan
hampir 100Y6 murni dan siap digunakan sebagai vektor kloning. DNA plasmid hanya terbentuk
sebagian kecil dari total DNA dalam sel bakteri. Oleh karena itu, hasil DNA dari kultur bakteri
mungkin sangat rendah. Amplifikasi plasmid perlu dilakukan, tujuannya adalah untuk
meningkatkan jumlah salinan plasmid.
3) Pembentukan DNA Rekombinan
Setelah sampel DNA murni disiapkan, langkah berikutnya dalam eksperimen kloning gen
adalah konstruksi molekul DNA rekombinan. Untuk menghasilkan molekul rekombinan ini,
vektor, serta DNA yang akan dikloning, harus dipotong pada titik titik tertentu dan kemudian
digabungkan bersama secara terkendali. Memotong dan menyambung adalah dua contoh teknik
manipulasi DNA, berbagai variasinya telah dikembangkan selama beberapa tahun terakhir. Selain
dipotong dan digabungkan, molekul DNA dapat diperpendek, atau diperpanjang, disalin menjadi
RNA atau menjadi molekul DNA baru, dan dimodifikasi dengan penambahan atau penghilangan
gugus kimia tertentu. Manipulasi ini, yang semuanya dapat dilakukan di dalam tabung reaksi,
memberikan dasar tidak hanya untuk kloning gen, tetapi juga untuk studi biokimia DNA, struktur
gen, dan kontrol ekspresi gen.
 Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan enzim yang dimurnikan. Di dalam
sel, enzim-enzim ini berpartisipasi dalam proses penting seperti replikasi dan transkripsi DNA,
pemecahan DNA asing atau yang tidak diinginkan (misalnya, DNA virus yang menyerang),
perbaikan DNA yang bermutasi, dan rekombinasi antara molekul DNA yang berbeda. Manipulasi
pemotongan dan penyambungan yang mendasari kloning gen dilakukan oleh enzim yang disebut
restriksi endonuklease (untuk pemotongan) dan ligase (untuk penyambungan).

Enzim restriksi endonuklease dapat digunakan dalam proses ini untuk mendapatkan
fragmen DNA yang di inginkan. Setiap enzim restriksi memotong DNA pada urutan basa tertentu,
yang disebut urutan pengenalan, yang dapat divariasikan dari 4 menjadi 16 atau 20 pasangan basa.
Jika kita mendalilkan bahwa pengenalan DNA didistribusikan secara acak dalam molekul DNA,
maka kita dapat menghitung berapa banyak enzim memotong molekul DNA. Suatu pengertian
yang penting harus diketahui, yaitu bahwa untuk setiap posisi molekul DNA terdapat empat
kemungkinan, (A, C, G, atau T). Oleh karena itu, enzim restriksi yang mengenali urutan empat
nukleotida, mereka akan memotong sekali per masing-masing 256 bps (atau 44). Enzim lain yang
mengenali enam urutan nukleotida, dapat memotong sekali per masing-masing 4096 bps (atau 46).
Setelah identitas enzim restriksi diketahui, maka harus diketahui bagaimana enzim restriksi
mengidentifikasi sekuens pengenalan yang tersedia pada DNA untuk memotongnya. Jadi
bagaimana enzim menemukan urutan pengenalannya? Sebagian besar enzim restriksi mengenali
dan memotong sekuens DNA palindrom. Urutan ini mewakili substrat yang terkena serangan oleh
restriksi endonuklease.
 Setelah memotong molekul DNA asing dengan enzim restriksi yang sesuai, demikian juga
vector harus dipotong dengan enzim restriksi yang sama, kemudian di ligasi dengan enzim ligase.
Ligase ini bergabung dengan fragmen DNA secara kovalen. Dua persyaratan harus dipenuhi agar
enzim ligase dapat melakukan tugasnya. Pertama, molekul harus menjadi substrat yang benar,
yaitu, mereka harus memiliki gugus 3'-hidroksil dan 5'-fosfat. Kedua, gugus-gugus pada molekul
yang akan digabungkan harus diposisikan dengan benar terhadap satu sama lain. Jika DNA ligase
menemukan dua fragmen DNA yang disatukan dari ujungnya, itu akan menyegelnya bersama-
sama. Dalam eksperimen rekayasa genetika, fragmen DNA yang ujungnya lengket cenderung
menyatu untuk waktu yang lama. Fragmen DNA ujung tumpul tidak memiliki cara untuk
disatukan, mereka berada jauh dari satu sama lain. Akibatnya, penyegelan ujung tumpul sangat
lambat dan membutuhkan konsentrasi enzim ligase yang tinggi, selain konsentrasi fragmen DNA
yang tinggi untuk disegel. Semua sel hidup menghasilkan DNA ligase, tetapi enzim yang
digunakan dalam rekayasa genetika biasanya dimurnikan dari bakteri E. coli yang telah terinfeksi
faga T4.
4) Transformasi

Setelah pembuatan DNA rekombinan, langkah selanjutnya dalam eksperimen kloning gen
adalah memasukkan molekul molekul ini ke dalam sel hidup, (Transformasi) biasanya bakteri,
yang kemudian tumbuh dan membelah untuk menghasilkan klon. Sebenarnya, kata "kloning"
hanya mengacu pada prosedur tahap selanjutnya, dan bukan pada konstruksi molekul DNA
rekombinan itu sendiri.

Kloning mempunyai dua tujuan utama yaitu: Pertama, memungkinkan sejumlah besar
molekul DNA rekombinan untuk diproduksi dari bahan awal dalam jumlah terbatas. Pada awalnya
hanya beberapa nanogram DNA rekombinan yang mungkin tersedia, tetapi setiap bakteri yang
mengambil plasmid kemudian membelah berkali kali untuk menghasilkan koloni, setiap sel yang
berisi banyak salinan molekul. Beberapa mikrogram DNA rekombinan biasanya dapat dibuat dari
satu koloni bakteri, menunjukkan peningkatan seribu kali lipat dari jumlah awal. Jika koloni
digunakan bukan sebagai sumber DNA tetapi sebagai inokulum untuk biakan cair, sel yang
dihasilkan dapat menyediakan miligram DNA, peningkatan hasil satu juta kali lipat. Dengan cara
ini kloning dapat menyediakan sejumlah besar DNA yang dibutuhkan untuk studi tentang struktur
dan ekspresi gen.
Fungsi penting kedua dari kloning dapat digambarkan sebagai pemurnian. Manipulasi yang
menghasilkan molekul DNA rekombinan jarang dapat dikontrol sejauh tidak ada molekul DNA
lain yang hadir pada akhir prosedur. Campuran ligasi selain molekul rekombinan yang diinginkan,
dapat mengandung sejumlah sebagai berikut.
a. Molekul vektor tidak terikat,

b. Fragmen DNA tidak terikat,

c. Molekul vektor yang telah disirkulasi ulang tanpa memasukkan DNA baru (vektor “self-
ligated”)
d. Molekul DNA rekombinan yang membawa fragmen DNA yang salah disisipkan.

Molekul yang tidak terikat jarang menyebabkan masalah karena, meskipun mereka dapat
diambil oleh sel bakteri, hanya dalam keadaan luar biasa mereka akan direplikasi. Lebih jauh
mungkin bahwa enzim di dalam bakteri inang mendegradasi potongan potongan DNA ini. Molekul
vektor self-ligated dan plasmid rekombinan yang salah lebih penting karena mereka direplikasi
sama efisiennya dengan molekul yang diinginkan. Namun, pemurnian molekul yang diinginkan
masih dapat dicapai melalui kloning karena bagi satu sel tidak biasa untuk mengambil lebih dari
satu molekul DNA. Setiap sel memunculkan satu koloni, sehingga setiap klon yang dihasilkan
terdiri dari sel sel yang semuanya mengandung molekul yang sama. Tentu saja, koloni yang
berbeda mengandung molekul yang berbeda: beberapa mengandung molekul DNA rekombinan
yang diinginkan, beberapa memiliki molekul semut rekombinan yang berbeda, dan beberapa
mengandung vektor self-ligated. Oleh karena itu, masalahnya bagaimana untuk mengidentifikasi
koloni yang mengandung plasmid rekombinan yang benar.
Sebagian besar spesies bakteri mampu mengambil molekul DNA dari media tempat
mereka tumbuh. Seringkali molekul DNA yang diambil dengan cara ini akan terdegradasi, tetapi
kadang kadang mampu bertahan dan bereplikasi di sel inang. Khususnya ini terjadi jika molekul
DNA plasmid dengan asal replikasi yang dikenali oleh inang. Di alam, transformasi mungkin
bukan proses utama dimana bakteri memperoleh informasi genetik. Hal ini dicerminkan oleh fakta
bahwa di laboratorium hanya beberapa spesies (terutama anggota genus Bacillus dan
Streptococcus) yang dapat diubah dengan mudah. Studi tentang ini ini telah mengungkapkan
bahwa mereka memiliki mekanisme canggih untuk pengikatan dan penyerapan DNA. Sebagian
besar spesies bakteri, termasuk E. coli, hanya mengambil DNA dalam jumlah terbatas dalam
keadaan normal. Untuk mengubah spesies ini secara efisien, bakteri harus menjalani beberapa
bentuk perlakuan fisik dan/atau kimia yang meningkatkan kemampuannya untuk mengambil
DNA.
 Seperti banyak terobosan dalam teknologi DNA rekombinan, perkembangan menyangkut
transformasi terjadi pada awal 1970 an, ketika diamati bahwa sel sel E. coli yang telah direndam
dalam larutan garam sedingin es lebih efisien pada serapan DNA daripada sel yang tidak direndam.
Sebuah larutan 50 mM kalsium klorida (CaCl2) secara tradisional digunakan, meskipun garam
lain, terutama rubidium klorida, juga efektif. Persisnya mengapa perlakuan ini berhasil, belum
dipahami. Mungkin CaCI2 menyebabkan DNA mengendap di bagian luar sel, atau mungkin garam
bertanggung jawab atas beberapa hal jenis perubahan pada dinding sel yang meningkatkan
pengikatan DNA. Bagaimanapun, perendaman CaCl2 hanya mempengaruhi pengikatan DNA, dan
bukan penyerapan sebenarnya ke dalam sel. Ketika DNA ditambahkan ke sel perlakuan, DNA
tetap melekat pada bagian luar sel, dan pada tahap ini tidak diangkut ke dalam sitoplasma.
Pergerakan DNA yang sebenarnya ke dalam sel yang kompeten dirangsang dengan menaikkan
suhu secara singkat hingga 42oC. Sekali lagi, alasan pasti mengapa kejutan panas ini efektif belum
dipahami.

Transformasi sel yang kompeten adalah prosedur yang tidak efisien, betapapun hati hatinya
sel telah disiapkan. Meskipun 1 ng vektor plasmid yang disebut pUC8 dapat menghasilkan 1000-
10.000 transforman, ini mewakili penyerapan hanya 0,01% dari semua molekul yang tersedia.
Lebih jauh lagi, 10.000 transforman hanyalah sebagian kecil dari jumlah total sel yang ada dalam
kultur yang kompeten. Fakta terakhir ini berarti bahwa beberapa cara harus ditemukan untuk
membedakan sel yang telah mengambil plasmid dari ribuan yang belum ditransformasi.
5) Seleksi rekombinan
Penyerapan dan retensi plasmid stabil biasanya dideteksi dengan mencari ekspresi gen
yang dibawa oleh plasmid. Misalnya, sel E. coli biasanya sensitif terhadap efek penghambatan
pertumbuhan antibiotik ampisilin dan tetrasiklin. Namun, sel-sel yang mengandung plasmid, yang
merupakan salah satu vektor kloning pertama yang dikembangkan pada tahun 1970-an, resisten
terhadap antibiotik ini. Ini karena pBR322 membawa dua set gen, satu gen yang mengkode enzim
b-laktamase yang mengubah ampisilin menjadi bentuk yang tidak beracun bagi bakteri, dan set
kedua gen yang mengkode enzim yang mendetoksifikasi tetrasiklin. Setelah percobaan
transformasi dengan pBR322, hanya sel E. coli yang telah mengambil plasmid ampRtetR dan
mampu membentuk koloni pada media agar yang mengandung ampisilin atau tetrasiklin, non-
transforman, yang masih ampStetS, tidak menghasilkan koloni pada media selektif. Karena itu
transforman dan nontransforman mudah dibedakan.

Kebanyakan vektor kloning plasmid membawa setidaknya satu gen yang memberikan
resistensi antibiotik pada sel inang, pemilihan transforman dengan pelapisan ke media agar yang
mengandung antibiotik yang relevan. Akan tetapi, perlu diingat bahwa resistensi terhadap
antibiotik tidak hanya disebabkan oleh adanya plasmid dalam sel yang diubah. Gen resistensi pada
plasmid juga harus diekspresikan, sehingga enzim yang mendetoksifikasi antibiotik dapat
disintesis. Ekspresi gen resistensi dimulai segera setelah transformasi, tetapi akan membutuhkan
beberapa menit sebelum sel mengandung cukup enzim untuk dapat menahan efek toksik antibiotik.
Untuk alasan ini bakteri yang diubah tidak boleh dilapiskan ke media selektif segera setelah
perlakuan kejut panas, tetapi pertamatama ditempatkan dalam volume kecil media cair, tanpa
antibiotik, dan diinkubasi untuk waktu yang singkat. Replikasi dan ekspresi plasmid kemudian
dapat dimulai, sehingga ketika sel dilapisi dan bertemu dengan antibiotik, mereka telah
mensintesis enzim resistensi yang cukup untuk dapat bertahan hidup. Menumbuhkan ke media
selektif memungkinkan transforman untuk dibedakan dari non-transforman. Masalah berikutnya
adalah untuk menentukan koloni yang ditransformasikan yang terdiri dari sel-sel yang
mengandung molekul DNA rekombinan, dan yang mengandung molekul vektor self-ligated.
Sebagian besar vektor kloning, penyisipan fragmen DNA ke dalam plasmid menghancurkan
integritas salah satu gen yang ada pada molekul. Oleh karena itu rekombinan dapat diidentifikasi
karena karakteristik yang dikodekan oleh gen yang tidak aktif tidak lagi ditampilkan oleh sel inang.
| Meskipun inaktivasi penyisipan gen resistensi antibiotik memberikan cara yang efektif
untuk identifikasi rekombinan, metode ini dibuat tidak nyaman dengan kebutuhan untuk
melakukan dua skrining, satu dengan antibiotik yang memilih untuk transforman, diikuti oleh yang
kedua, setelah pelapisan replika, dengan antibiotik yang membedakan rekombinan. Oleh karena
itu, kebanyakan vektor plasmid modern menggunakan sistem yang berbeda. Contohnya adalah
pUC8, yang membawa gen resistensi ampisilin dan gen yang disebut lacZ', yang mengkode bagian
dari enzim b-galaktosidase. Kloning dengan pUC8 melibatkan inaktivasi penyisipan gen lacZ',
dengan rekombinan diidentifikasi karena ketidakmampuan mereka untuk mensintesis β-
galaktosidase. Enzim β -Galaktosidase adalah salah satu dari serangkaian enzim yang terlibat
dalam pemecahan laktosa menjadi glukosa dan galaktosa, biasanya dikodekan oleh gen lacZ, yang
berada pada kromosom E. coli. Beberapa galur E. coli memiliki gen lacZ yang dimodifikasi, gen
yang tidak memiliki segmen sebagai lacZ' dan mengkode bagian a peptida dari b-galaktosidase.
Mutan ini dapat mensintesis enzim hanya ketika mereka memiliki plasmid, seperti pUC8, yang
membawa segmen lacZ' yang hilang dari gen. Eksperimen kloning dengan pUC8 melibatkan
pemilihan transforman pada agar ampisilin diikuti dengan seleksi aktivitas β-galaktosidase untuk
mengidentifikasi rekombinan. Sel yang memiliki plasmid pUC8 normal adalah ampR dan mampu
mensintesis b-galaktosidase membentuk koloni yang berwarna biru, sedangkan sel rekombinan
juga ampR tetapi tidak dapat membuat β-galaktosidase membentuk koloni berwarna putih.
 Cara transformasi DNA ke dalam ragi, jamur, hewan, dan tumbuhan juga diperlukan jika
organisme ini akan digunakan sebagai inang untuk kloning gen. Sebenarnya, proses-proses ini
bukanlah "transformasi", karena istilah itu memiliki arti khusus yang hanya berlaku untuk
pengambilan DNA oleh bakteri. Namun, ahli biologi molekuler telah melupakan ini selama
bertahun-tahun dan "transformasi" sekarang digunakan untuk menggambarkan penyerapan DNA
oleh organisme apa pun. Secara umum, perendaman sel dalam garam hanya efektif dengan
beberapa spesies bakteri, meskipun perlakuan dengan litium klorida atau litium asetat
meningkatkan pengambilan DNA oleh sel ragi, dan sering digunakan dalam transformasi
Saccharomyces cerevisiae. Namun, untuk sebagian besar organisme yang lebih tinggi, diperlukan
metode yang lebih canggih.
Sebagian besar organisme, penghalang utama untuk pengambilan DNA adalah dinding sel.
Sel hewan yang dikultur, yang biasanya tidak memiliki dinding sel, mudah diubah, terutama jika
DNA diendapkan ke permukaan sel dengan kalsium fosfat atau dalam liposom yang menyatu
dengan membran sel. Untuk jenis sel lainnya jawabannya sering kali adalah dengan
menghilangkan dinding selnya. Enzim yang mendegradasi ragi, jamur, dan dinding sel tumbuhan
tersedia, dan di bawah kondisi yang tepat protoplas utuh dapat diperoleh. Protoplas umumnya
mengambil DNA cukup mudah, tetapi transformasi dapat dirangsang dengan teknik khusus seperti
elektroporasi, di mana sel sel dikenakan pulsa listrik pendek, dianggap menginduksi pembentukan
sementara pori pori di membran sel, sehingga molekul DNA dapat masuk ke dalam sel. Setelah
transformasi protoplas dicuci untuk menghilangkan enzim degradatif dan dinding sel secara
spontan terbentuk kembali.
Berbeda dengan sistem transformasi yang dijelaskan sejauh ini, ada dua metode fisik untuk
memasukkan DNA ke dalam sel eukaryot. Yang pertama adalah injeksi mikro, yang menggunakan
pipet yang sangat halus untuk menyuntikkan molekul DNA langsung ke dalam inti sel yang akan
diubah. Teknik ini awalnya diterapkan pada sel hewan tetapi kemudian berhasil dengan sel
tumbuhan. Metode kedua melibatkan pemboman sel dengan mikroproyektil kecepatan tinggi,
biasanya partikel emas atau tungsten yang telah dilapisi dengan DNA. Proyektil mikro ini
ditembakkan ke sel dari senjata partikel. Teknik yang tidak biasa ini disebut biolistik dan telah
digunakan dengan sejumlah jenis sel yang berbeda.
Transformasi dengan hewan dan tumbuhan, produk akhir yang diinginkan mungkin bukan
sel yang ditransformasi, tetapi organisme yang ditransformasi. Tanaman relatif mudah untuk
diregenerasi dari sel yang dikultur, oleh karena itu, satu sel tanaman yang ditransformasi dapat
menghasilkan tanaman yang ditransformasi yang membawa DNA kloning di setiap sel, dan
meneruskan DNA kloning ke keturunannya setelah pembungaan dan pembentukan biji. Hewan,
tentu saja tidak dapat diregenerasi dari sel yang dikultur, jadi untuk mendapatkan hewan yang
ditransformasi memerlukan pendekatan yang lebih halus. Salah satu teknik dengan mamalia
seperti tikus adalah mengeluarkan telur yang telah dibuahi dari saluran telur, menyuntikkan mikro
DNA, dan kemudian menanamkan kembali sel-sel yang telah diubah ke dalam saluran reproduksi
induk.
 Meskipun ada banyak prosedur berbeda untuk mendapatkan klon yang diinginkan,
semuanya merupakan variasi pada dua metode dasar:

a. Seleksi langsung untuk gen yang diinginkan, yang berarti bahwa percobaan kloning
dirancang sedemikian rupa sehingga satu-satunya klon yang diperoleh adalah klon dari gen yang
dibutuhkan. Hampir selalu, seleksi terjadi pada tahap pelapisan.
b. Identifikasi klon dari perpustakaan gen, yang merupakan senjata awal kloning, untuk
menghasilkan perpustakaan klon yang mewakili semua atau sebagian besar gen yang ada dalam
sel, diikuti dengan analisis klon individu untuk mengidentifikasi yang benar. Kedua metode
identifikasi telah dijelaskan di atas.
Kloning gen di Indonesia

Seiring berkembangnya pemikiran manusia dan teknologi yang memadai, metode kloning tidak
lagi mempergunakan sel sperma dan sel telur, tetapi menggunakan sel telur dan sel apa saja selain
sperma. Dengan demikian, seorang anak nantinya dapat lahir ke dunia tanpa memerlukan sel
sperma ayah. Lebih dalam, tidak menutup kemungkinan akan lahir anak dalam perkawinan sejenis,
karena hanya sel telur yang dibutuhkan lalu menitipkan sel telur tersebut pada rahim seorang
wanita yang merupakan ibu pengganti (surrogate mother).
Kehadiran kloning secara umum membawa dampak positif bagi para banyak calon orang tua yang
ingin memiliki buah hati tetapi terhalang karena tidak memiliki kemampuan untuk melakukan
prokreasi. Kloning juga turut membantu memperbaiki kecacatan genetik yang dimiliki oleh para
orang tua yang beresiko mewarisinya. Sel telur yang difertilisasi dapat diklon dan hasil duplikat
dicobakan untuk penyakit atau kecacatan. Jika hasilnya bebas dari cacat gentik, klon lainnya dapat
digunakan dan dapat diimplantasikan pada wanita yang membutuhkan.
Di samping dampak positif yang akan didapatkan, kloning juga dapat berdampak negatif yang
meresahkan keberlangsungan hidup manusia. Tidak menutup kemungkinan suatu negara dapat
mengembangan manusia dengan memaksimalkan ciri tertentu, seperti yang diinginkan oleh Nazi
Jerman. Sebab, sekali manusia dikembangkan maka kloning dapat digunakan untuk
memperbanyak individu dan menghasilkan banyak klon. Ditambah, dengan tindakan yang sama,
kloning mampu mengeksploitasi genetik dengan mengkreasikan genetik di bawah standar. Embrio
yang telah lahir di janin wanita dan dapat dikatakan sebagai subjek manusia pun dapat
kemungkinan terbunuh karena tindakan eksploitasi genetik dalam kloning.
Kloning secara eksplisit tidak diatur dalam ketentuan peraturan perundang-undangan di Indonesia.
Akan tetapi, dikarenakan kloning merupakan metode prokreasi tanpa melalui proses aseksual,
maka hal tersebut dapat dikatakan memiliki kesamaan dengan upaya kehamilan di luar cara
alamiah sebagaimana yang telah diatur ketentuannya dalam Undang-Undang Nomor 36 Tahun
2009 Tentang Kesehatan (“UU Kesehatan”). Dalam Pasal 127 Ayat (1) UU Kesehatan disebutkan
bahwa upaya kehamilan di luar cara alamiah hanya dapat dilakukan oleh pasangan suami istri yang
sah dengan ketentuan, yakni hasil pembuahan sperma dan ovum dari suami istri yang bersangkutan
ditanamkan dalam rahim istri dari mana ovum berasal, dilakukan oleh Tenaga Kesehatan yang
mempunyai keahlian dan kewenangan untuk itu, dan pada fasilitas kesehatan tertentu. Dilanjutkan
pada ayat (2), ketentuan mengenai persyaratan kehamilan di luar cara alamiah sebagaimana
dimaksud pada ayat (1) diatur dengan Peraturan Pemerintah.
Peraturan Pemerintah yang dimaksud dalam pasal tersebut adalah Peraturan Pemerintah No. 61
Tahun 2014 Tentang Kesehatan Reproduksi (“PP Kesehatan Reproduksi”). Dalam Pasal 40 Ayat
(1) disebutkan bahwasanya reproduksi dengan bantuan atau kehamilan di luar cara alamiah hanya
dapat dilakukan pada pasangan suami istri yang terikat perkawinan yang sah dan mengalami
ketidaksuburan atau infertilitas untuk memperoleh keturunan. Kemudian Ayat (2) menjelaskan
bahwa dilaksanakan dengan menggunakan hasil pembuahan sperma dan ovum yang berasal dari
suami istri yang bersangkutan dan ditanamkan dalam rahim istri dari mana ovum berasal.
Kemudian disebutkan pula dalam melakukan reproduksi dengan bantuan atau kehamilan di luar
cara alamiah, harus dilakukan sesuai dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi serta
tidak bertentangan dengan norma agama. Hal tersebut diperjelas dengan ketentuan bahwa
reproduksi dengan bantuan atau kehamilan di luar cara alamiah juga harus dilakukan oleh Tenaga
Kesehatan yang mempunyai kompetensi dan kewenangan.
Perkembangan kloning di dunia, ibarat sebuah pisau bermata dua terhadap keberlangsungan hidup
manusia. Secara teoritis, kloning dapat dilakukan tanpa melalui proses perkawinan yang sah dan
dapat menggunakan sel telur serta sel apa saja selain sperma dari suami istri yang bersangkutan.
Menurut Hukum Positif, tindakan tersebut tentu saja sudah melanggar Pasal 127 UU Kesehatan.
Bantuan infertilitas dalam metode kloning merupakan pemecah masalah dari ketidaksuburan yang
dialami oleh wanita. Namun, tidak dapat mengabaikan fakta bahwa para ilmuwan pencipta kloning
domba Dolly harus melakukan percobaan sebanyak 277 kali agar berhasil. Clonaid, pencipta bayi
Eve, mengklaim bahwa pihaknya menggunakan lebih dari 200 sel telur manusia dari sel dewasa
untuk mendapatkan sepuluh yang tumbuh normal tetapi hanya lima yang dapat dimplantasikan
dengan sukses. Bercermin dari eksperimen-eksperimen tersebut, kloning untuk manusia akan
melewati prosedur yang jauh lebih rumit dan tidak menutup kemungkinan terjadi pembunuhan
ataupun kematian embrio dalam janin nantinya.
Pembunuhan ataupun kematian embrio menurut Kitab Undang-Undang Hukum Pidana (KUHP)
merupakan suatu bentuk kejahatan sehingga dapat dijatuhi sanksi pidana. Pengaturan lebih rinci
terkait pasal dalam KUHP yang dimaksud terdapat dalam beberapa pasal, yakni Pasal 346 KUHP
jika pelakunya merupakan perempuan, Pasal 347 jika pelakunya orang lain dengan tidak memiliki
izin perempuan, Pasal 348 jika pelakunya merupakan orang lain dengan memiliki izin perempuan,
dan Pasal 349 jika pelakunya memiliki jabatan. Di samping itu, menurut Hukum Perdata, embrio
yang terdapat dalam janin manusia sudah dapat dikatakan sebagai subjek hukum karena dianggap
telah hidup sehingga memiliki hak terkait hak waris sebagaimana yang termaktub dalam Pasal 852
Kitab Undang-Undang Hukum Perdata (KUHPer). Teranglah diketahui, jika terjadi kematian
ataupun terbunuhnya embrio akan berpengaruh terhadap hak waris anak tersebut, yang mana
menyebabkan hak anak tersebut atas waris hilang karena dianggap tidak pernah ada.
Lahirnya embrio tersebut ke dunia ternyata tidak menyelesaikan permasalahan hukum dengan
begitu saja. Embrio yang lahir dan menjadi seorang manusia akan mengalami kesulitan
mengetahui status hukumnya dalam hak pewarisan dan dalam hal pembuktian pengingkaran
dan/atau pengakuan anak di kemudian hari, yang memerlukan tes DNA ataupun Akta Kelahiran.
Menurut Undang-Undang Nomor 1 Tahun 1974 Tentang Perkawinan (UU Perkawinan), anak yang
sah merupakan anak yang dilahirkan dalam atau akibat perkawinan yang sah. Anak yang lahir
menggunakan metode kloning nantinya hanya akan memiliki hubungan darah dengan salah satu
pihak, baik ibu atau ayah, bahkan tidak menutup kemungkinan lahir hubungan darah dengan pihak
lain di luar kedua orang tua sebab sel telur dan DNA yang diambil berasal dari orang lain.
Salah satu kemungkinan penyebab berbedanya hubungan darah karena adanya pembuahan di luar
rahim oleh sel telur milik ibu pengganti (surrogate mother). Surrogate mother merupakan suatu
perjanjian antara seorang wanita yang mengikatkan diri melalui suatu perjanjian dengan pihak lain
(suami istri) untuk menjadi hamil terhadap hasil pembuahan suami istri tersebut yang ditanamkan
ke dalam rahimnya, dan setelah melahirkan diharuskan menyerahkan bayi tersebut kepada pihak
suami isteri berdasarkan perjanjian yang dibuat. Dengan kata lain, perempuan penampung
pembuahan telah menyewakan rahimnya. Perjanjian sewa rahin ini bila mengacu pada Hukum
Positif Indonesia tidak diperbolehkan karena prokreasi yang terjadi bukan berasal dari pasangan
suami istri yang terikat perkawinan sah. Apabila terdapat polemik mengenai status hukum anak
dalam waris, anak tersebut akan bergantung pada pembuktian pengingkaran dan/atau pengakuan
anak yang bukan jalan mudah untuk ditempuh.
Hukum Positif Indonesia juga mengacu pada ketentuan Hukum Islam ketika melangsungkan
kloning. Islam mempercayai bahwasanya hubungan suami istri melalui perkawinan merupakan
landasan bagi pembentukan masyarakat yang diatur berdasarkan tuntuhan Allah swt. Anak yang
lahir dalam perikatan perkawinan tidak hanya membawa komponen genetik kedua orang tua, tetapi
juga membawa identitas bagi anak. Kloning dalam hal ini dipercayai akan berujung pada hilangnya
garis keturunan yang berakibat hilangnya hak anak dan terabaikannya sejumlah hukum yang
timbul. Kemudian dikarenakan proses prokreasi dapat dilakukan secara aseksual, maka institusi
perkawinan yang telah disyariatkan sebagai media berketurunan secara sah tidak diperlukan lagi,
lembaga keluarga melalui perkawinan menjadi hancur, dan tidak ada lagi saling memerlukan
antara laki-laki dan perempuan.
Setelah memaparkan penjelasan mengenai kloning di atas, sudah teranglah bahwasanya
masyarakat tidak dapat serta merta menerima penggunaan teknologi biomedik. Kloning yang dapat
membahayakan keberlangsungan masyarakat ini, sampai saat sekarang belum memiliki
kedudukan yang pasti di mata hukum. Namun, dapat diketahui bahwa kloning telah melanggar
Hukum Positif Indonesia. Oleh karena itu, perlu diatur lebih lanjut hukum mengenai kloning
sehingga terdapat kepastian hukum dan para pihak yang dirugikan mendapatkan payung hukum.
3. PENSTRUKTURAN IDE
 Hasil pencetusan ide bersama dengan kelompok saudara rancanglah proyek tentang
cloning gen. Bahaslah naskah rancangan tersebut tulislah/gambarkan/ skenariokan tentang
bagaimana tahapan-tahapan Cloning Gen? bagaimana seleksi Cloning Gen? Bahaslah bahan dan
alat yang digunakan untuk menyelesaikan proyek tersebut.

Jawaban :

Hasil pencetusan ide bersama dengan kelompok kami berikut rancang proyek tentang
cloning gen. Hasil analisa telah kami bahas seperti rancangan mengenai tulislah/gambarkan/
tentang bagaimana tahapan-tahapan Cloning Gen? Bagaimana seleksi Cloning Gen?

SKENARIO VIDEO MENGENAI CLONING GEN

NO. INDIKATOR VISUAL

1. Pembukaan/sal Seluruh anggota memberi salam dan memperkenalkan
am diri masing-masing
2. Pokok bahasan Anggota kelompok menyampaikan pokok pembahasan
materi materi pada perkuliahan pertemuan ke sebelas yaitu
mengenai Cloning Gen.
3. Tujuan Ditampilkan teks tujuan pembelajaran pada pertemuan
pembelajaran pertama kuliah yaitu mahasiswa mampu mengkaji
implikasi tentang Cloning Gen. Serta didukung oleh
audio.
4. Materi singkat Pada video ditampilkan teks materi singkat mengenai
(maksimal 100 Cloning Gen dan didukung oleh audio yang sesuai.
kata)
5. Bahan/objek - Bahan/objek yang digunakan yaitu Anggota
serta alat yang kelompok.
digunakan - Alat yang digunakan yaitu laptop dan kamera
Handphone dalam pembuatan dan editing
video
6. Prosedur 1. Cari dan pahami materi mengenai Cloning Gen.
proyek
 2. Bagaimana tahapan-tahapan cloning gen? Dan
bagaimana seleksi cloning gen?
3. Sediakan alat dan bahan untuk pembuatan
video.
4. Rekam video proyek yang telah dibuat dengan
semenarik mungkin.

7. Pelaksanaan Pendahuluan :
proyek Kloning Gen.

Mengkloning berarti membuat salinan yang identik.

Kloning DNA melibatkan pemisahan gen tertentu atau
segmen DNA dari kromosom, menggabungkannya ke
DNA vector, hasilnya merupakan DNA hibrida yang
disebut DNA rekombinan. Selanjutnya DNA
Rekombinan ditransformasi ke dalam sel inang yang
tepat (bakteri, virus atau ragi) dan direplikasi untuk
membuat banyak salinan dari gen yang dipilih. Adapun
bahan-bahan dasar (utama) yang digunakan dalam
proses cloning adalah sebagai berikut:

1. Fragmen DNA, adalah gen target yang akan

dikloning.
2. Vektor, adalah molekul DNA untai ganda,
melingkar atau linier yang dapat menghasilkan
molekul DNA rekombinan dalam proses
kloning. Vektor mampu membawa gen target ke
dalam sel inang melalui proses transformasi.
3. Sel inang, adalah sel hidup yang mampu
ditumpangi oleh vector asli atau rekombinan.
Sel inang dapat berupa organisme uniselular
(bersel tunggal) seperti bakteri, maupun
 multiselular (bersel banyak) seperti jamur,
tumbuhan, hewan hingga manusia. Sel inang
mampu memperbanyak vektor, menghasilkan
banyak salinan identik, tidak hanya dari dirinya
sendiri tetapi juga dari gen yang dibawanya.
Ketika sel inang membelah, salinan molekul
DNA rekombinan diteruskan keketurunan dan
replikasi vektor lebih lanjut terjadi. Setelah sel
inang melakukan pembelahan sel, koloni, atau
klon yang diproduksi, maka setiap sel dalam
klon berisi satu atau lebih salinan molekul DNA
rekombinan, gen yang dibawa oleh molekul
rekombinan sekarang dikatakan telah dikloning.
4. Enzim restriksi endonuklease, dan enzim ligase.
Enzim restriksi endonuklease adalah enzim
yang diperlukan untuk memotong untai DNA
yang di inginkan, sedangkan enzim ligase
digunakan untuk meligasi DNA sehingga
memperoleh DNA rekombinan.

Langkah-langkah dalam Kloning Gen.

1. Persiapan DNA sel total.

Langkah pertama dalam proses cloning gen
adalah persiapan DNA yang diinginkan atau
fragmen DNA target. Persiapan DNA target
dilakukan dengan mempertimbangkan jenis
prosedur pemurnian DNA yang paling
sederhana, di mana seluruh komplemen DNA
dari sel bakteri diperlukan. Prosedur preparasi
DNA total dari kultur sel bakteri dapat dibagi
menjadi empat tahap (Gambar 101):
1. Kultur bakteri ditumbuhkan dan kemudian
dipanen.
2. Sel-sel dipecah untuk mendapatkan DNAnya.
3. Ekstrak sel ini diperlakukan pemurnian untuk
menghilangkan semua komponen kecuali DNA.
4. Larutan DNA yang dihasilkan terkonsentrasi.

2. Persiapan DNA Plasmid

Pemurnian plasmid dari kultur bakteri melibatkan

strategi umum yang sama seperti preparasi DNA sel
total. Kultur sel, yang mengandung plasmid,
ditumbuhkan dalam medium cair, dipanen, dan
ekstrak sel disiapkan. Protein dan RNA dihilangkan,
dan DNA mungkin terkonsentrasi oleh
pengendapan etanol. Namun, ada perbedaan penting
antara pemurnian plasmid dan persiapan DNA sel
total. Dalam preparasi plasmid selalu perlu untuk
memisahkan DNA plasmid dari sejumlah besar
DNA kromosom bakteri yang juga ada di dalam sel.
Memisahkan kedua jenis DNA ini bisa sangat sulit,
tetapi tetap penting jika plasmid akan digunakan
sebagai vektor kloning. Kehadiran jumlah terkecil
DNA bakteri yang mencemari dalam percobaan
kloning gen dapat dengan mudah menyebabkan
hasil yang tidak diinginkan. Untungnya beberapa
metode tersedia untuk menghilangkan DNA bakteri
selama pemurnian plasmid, dan penggunaan metode
ini, secara individu atau kombinasi, dapat
menghasilkan isolasi DNA plasmid yang sangat
murni. Plasmid dan kromosom bakteri berbentuk
sirkular, tetapi selama preparasi ekstrak sel,
kromosom selalu dipecah untuk menghasilkan
fragmen-fragmen linier. Oleh karena itu, metode
untuk memisahkan molekul melingkar dari molekul
linier akan menghasilkan plasmid murni.

3. Pembentukan DNA Rekombinan.

Setelah sampel DNA murni disiapkan, langkah

berikutnya dalam eksperimen kloning gen adalah
konstruksi molekul DNA rekombinan. Untuk
menghasilkan molekul rekombinan ini, vektor, serta
DNA yang akan dikloning, harus dipotong pada
titik-titik tertentu dan kemudian digabungkan
bersama secara terkendali. Memotong dan
menyambung adalah dua contoh teknik manipulasi
DNA, berbagai variasinya telah dikembangkan
selama beberapa tahun terakhir. Selain dipotong dan
digabungkan, molekul DNA dapat diperpendek,
atau diperpanjang, disalin menjadi RNA atau
menjadi molekul DNA baru, dan dimodifikasi
dengan penambahan atau penghilangan gugus kimia
tertentu. Manipulasi ini, yang semuanya dapat
dilakukan di dalam tabung reaksi, memberikan
dasar tidak hanya untuk kloning gen, tetapi juga
untuk studi biokimia DNA, struktur gen, dan
kontrol ekspresi gen.

4. Transformasi

Setelah pembuatan DNA rekombinan, langkah

selanjutnya dalam eksperimen kloning gen adalah
memasukkan molekul-molekul ini ke dalam sel
hidup, (Transformasi) biasanya bakteri, yang
kemudian tumbuh dan membelah untuk
menghasilkan klon. Sebenarnya, kata “kloning”
hanya mengacu pada prosedur tahap selanjutnya,
dan bukan pada konstruksi molekul DNA
rekombinan itu sendiri.

Kloning mempunyai dua tujuan utama yaitu:

Pertama, memungkinkan sejumlah besar molekul
DNA rekombinan untuk diproduksi dari bahan awal
dalam jumlah terbatas. Pada awalnya hanya
beberapa nanogram DNA rekombinan yang
mungkin tersedia, tetapi setiap bakteri yang
mengambil plasmid kemudian membelah berkali-
kali untuk menghasilkan koloni, setiap sel yang
berisi banyak salinan molekul. Beberapa mikrogram
DNA rekombinan biasanya dapat dibuat dari satu
koloni bakteri, menunjukkan peningkatan seribu
kali lipat dari jumlah awal. Jika koloni digunakan
bukan sebagai sumber DNA tetapi sebagai
inokulum untuk biakan cair, sel yang dihasilkan
dapat menyediakan miligram DNA, peningkatan
hasil satu juta kali lipat. Dengan cara ini kloning
dapat menyediakan sejumlah besar DNA yang
dibutuhkan untuk studi tentang struktur dan ekspresi
gen.

Fungsi penting kedua dari kloning dapat

digambarkan sebagai pemurnian. Manipulasi yang
menghasilkan molekul DNA rekombinan jarang
dapat dikontrol sejauh tidak ada molekul DNA lain
yang hadir pada akhir prosedur. Campuran ligasi
selain molekul rekombinan yang diinginkan, dapat
mengandung sejumlah sebagai berikut.

a. Molekul vektor tidak terikat,

b. Fragmen DNA tidak terikat,
c. Molekul vektor yang telah disirkulasi ulang
tanpa memasukkan DNA baru (vektor “self-
ligated”)
d. Molekul DNA rekombinan yang membawa
fragmen DNA yang salah disisipkan.

5. Seleksi rekombinan

Penyerapan dan retensi plasmid stabil biasanya

dideteksi dengan mencari ekspresi gen yang dibawa
oleh plasmid. Misalnya, sel E. Coli biasanya sensitif
terhadap efek penghambatan pertumbuhan
antibiotik ampisilin dan tetrasiklin. Namun, sel-sel
yang mengandung plasmid, yang merupakan salah
satu vektor kloning pertama yang dikembangkan
pada tahun 1970-an, resisten terhadap antibiotik ini.
Ini karena pBR322 membawa dua set gen, satu gen
yang mengkode enzim b-laktamase yang mengubah
ampisilin menjadi bentuk yang tidak beracun bagi
bakteri, dan set kedua gen yang mengkode enzim
yang mendetoksifikasi tetrasiklin. Setelah
percobaan transformasi dengan pBR322, hanya sel
E. Coli yang telah mengambil plasmid ampRtetR
dan mampu membentuk koloni pada media agar
yang mengandung ampisilin atau tetrasiklin; non-
transforman, yang masih ampStets, tidak
menghasilkan koloni pada media selektif. Karena
itu transforman dan non- transforman mudah
dibedakan.

Kebanyakan vektor kloning plasmid membawa

setidaknya satu gen yang memberikan resistensi
antibiotik pada sel inang, pemilihan transforman
dengan pelapisan ke media agar yang mengandung
antibiotik yang relevan. Akan tetapi, perlu diingat
bahwa resistensi terhadap antibiotik tidak hanya
disebabkan oleh adanya plasmid dalam sel yang
diubah. Gen resistensi pada plasmid juga harus
diekspresikan, sehingga enzim yang
mendetoksifikasi antibiotik dapat disintesis.
Ekspresi gen resistensi dimulai segera setelah
transformasi, tetapi akan membutuhkan beberapa
menit sebelum sel mengandung cukup enzim untuk
dapat menahan efek toksik antibiotik. Untuk alasan
ini bakteri yang diubah tidak boleh dilapiskan ke
media selektif segera setelah perlakuan kejut panas,
tetapi pertama- tama ditempatkan dalam volume
kecil media cair, tanpa antibiotik, dan diinkubasi
untuk waktu yang singkat. Replikasi dan ekspresi
plasmid kemudian dapat dimulai, sehingga ketika
sel dilapisi dan bertemu dengan antibiotik, mereka
telah mensintesis enzim resistensi yang cukup untuk
dapat bertahan hidup. Menumbuhkan ke media
selektif memungkinkan transforman untuk
dibedakan dari non-transforman. Masalah
berikutnya adalah untuk menentukan koloni yang
ditransformasikan yang terdiri dari sel-sel yang
mengandung molekul DNA rekombinan, dan yang
mengandung molekul vektor self-ligated. Sebagian
besar vektor kloning, penyisipan fragmen DNA ke
dalam plasmid menghancurkan integritas salah satu
gen yang ada pada molekul. Oleh karena itu
rekombinan dapat diidentifikasi karena karakteristik
yang dikodekan oleh gen yang tidak aktif tidak lagi
ditampilkan oleh sel inang.

Meskipun inaktivasi penyisipan gen resistensi

antibiotik memberikan cara yang efektif untuk
identifikasi rekombinan, metode ini dibuat tidak
nyaman dengan kebutuhan untuk melakukan dua
skrining, satu dengan antibiotik yang memilih untuk
transforman, diikuti oleh yang kedua, setelah
pelapisan replika, dengan antibiotik yang
membedakan rekombinan. Oleh karena itu,
kebanyakan vektor plasmid modern menggunakan
sistem yang berbeda. Contohnya adalah pUC8, yang
membawa gen resistensi ampisilin dan gen yang
disebut lacZ’, yang mengkode bagian dari enzim b-
galaktosidase. Kloning dengan pUC8 melibatkan
inaktivasi penyisipan gen lacZ’, dengan rekombinan
diidentifikasi karena ketidakmampuan mereka
untuk mensintesis ẞ-galaktosidase. Enzim ß –
Galaktosidase adalah salah satu dari serangkaian
enzim yang terlibat dalam pemecahan laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa, biasanya dikodekan
oleh gen lacz, yang berada pada kromosom E. Coli.
Beberapa galur E. Coli memiliki gen lacz yang
dimodifikasi, gen yang tidak memiliki segmen
sebagai lacZ’ dan mengkode bagian a-peptida dari
b-galaktosidase. Mutan ini dapat mensintesis enzim
hanya ketika mereka memiliki plasmid, seperti
pUC8, yang membawa segmen lacZ’ yang hilang
dari gen. Eksperimen kloning dengan pUC8
melibatkan pemilihan transforman pada agar
 ampisilin diikuti dengan seleksi aktivitas ẞ-
galaktosidase untuk mengidentifikasi rekombinan.
Sel yang memiliki plasmid pUC8 normal adalah
ampR dan mampu mensintesis b-galaktosidase
membentuk koloni yang berwarna biru, sedangkan
sel rekombinan juga ampR tetapi tidak dapat
membuat ẞ- galaktosidase membentuk koloni
berwarna putih.

Penutup :
Setelah menyampaikan materi singkat, dan
penjelasan mengenai Cloning Gen, bagaimana
tahapan-tahapan Coning Gen?, dan bagaimana seleksi
Cloning Gen?, video pembelajaran ini di tutup dengan
harapan dan ucapan salam.
8. Pembahasan Pada bagian ini dilakukan pembahasan mengenai materi
singkat video yang ditampilkan.
9. Kesimpulan Setelah pembahasan ditarik beberapa kesimpulan pada
materi yang telah dijelaskan, kesimpulan berupa teks
yang didukung oleh audio yang sesuai.

Kesimpulan video :
1. Mengkloning berarti membuat salinan yang
identik. Adapun bahan-bahan dasar (utama)
 yang digunakan dalam proses cloning adalah
sebagai berikut:
a. Fragmen DNA.
b. Vektor
c. Sel inang
d. Enzim restriksi endonuklease, dan
enzim ligase.
2. Langkah-langkah dalam Kloning Gen.
a. Persiapan DNA sel total.
b. Persiapan DNA Plasmid.
c. Pembentukan DNA Rekombinan.
d. Transformasi.
e. Seleksi rekombinan.

NO. LANGKAH KETERANGAN

PEMBUATAN PROYEK
1. Unduh dan install aplikasi
Cap-Cut Video Editor

2. Buka aplikasi CapCut yang

sudah di unduh.
3. Izinkan aplikasi CapCut
mengakses mengenai
sesuatu yang diperlukan,
seperti akses ke galeri, izin
menggunakan microphone,
dan kamera.
4. Setelah sudah masuk ke
beranda aplikasi CapCut,
pilih new project untuk
mulai mengedit video.

5. Pilihlah video yang ingin di

edit dari galeri.

6. Setelah itu akan di arahkan

ke tools untuk mengedit
video yang ingin diedit.
7. Klik audio untuk
menambahkan suara ke
video yang sedang diedit.

8. Klik sticker untuk

menambahkan stiker yang
di inginkan.

9. Untuk memasukan teks,

cukup menekan opsi text.
Disana ada banyak font
yang bisa di pilih.
 10. Jika ingin menambahkan
efek di video, cukup pilih
effects, dan akan muncul
opsi efek yang bisa
digunakan.

11. Setelah selesai mengedit,

tekan tanda simpan yang
ada di pojok kanan atas
layar handphone atau
laptop.

12. Tunggu hingga videonya

selesai.

4. APLIKASI
Berdasarkan rancangan yang telah di buat, kerjakanlah proyek bersama kelompok saudara,
dokumentasikanlah dalam bentuk video tentang cloning gen. Proyek dilakukan di luar jam kuliah,
sesual operasional prosedur Program Studi Pendidikan Kimia FKIP Unsri. Lakukanlah proyek
tersebut semenarik mungkin. Lakukanlah kolaborasi bersama teman-teman saudara dalam
menyelesaikan proyek tersebut. Dokumentasi video yang sudah di apload cantumkan link
videonya dibawah aplikasi sebelum pembahasan. Berdasarkan hasil proyek yang telah saudara
lakukan bahaslah hal-hal berikut ini: Pada pertemuan 11 yang telah saudara kerjakan, hasil
pemotongan DNA dengan enzim restriksi Bam H1, Jika salah satu fragmen DNA hasil dari
pemotongan Enzim Restriksi Bam H1 pada urutan DNA di cloning dengan vector pUC 19.
Rancanglah proses cloning tersebut. Analisislah seleksi rekombinan pada proses tersebut.
Jawab

Sequens DNA :
5’ATGGCTCGGCCCTCAAGTCGAGGTTATCAGAACTGCAACTCATATGATCGA
GAGGGAAATCAATTCTGTGAACGATAATCCAGTCATTGATGTTGCCAGAGAC
AAAGCT 3’
3’TACCGAGCCGGGAGTTCAGCTCCAATAGTCTTGACGTTGAGTATACTAGCT
CCCCTTTAGTTAAGTCACTTGCTATTAGGTCAGTAACTACAACGGTCTCTGTT
TCG5’
 Saat urutan DNA diatas direaksikan dengan enzim restriksi BamH1 (dengan sekuens
pengenalan GGATCC) maka tidak terjadi pemotongan fragmen DNA dikarenakan pada urutan
DNA tersebut tidak ditemukan urutan sisi pengenalan pemotongan dari enzim BamH1.
Dikarenakan tidak terdapat fragmen DNA hasil dari pemotongan Enzim Retriksi Bam
H1 pada sekuens DNA diatas, maka rancangan proses cloning dengan vector pUC19 dan hasil
analisis seleksii rekombinan pada proses tersebut tidak dapat ditemukan.

5. REFLEKSI

Selanjutnya hasil elaborasi dengan dosen, saat proses pembelajaran jika ada perbaikan
ditindaklanjuti dengan perbaikan, kemudian dituangkan dalam "Laporan 12 cloning Gen".
Laporan tersebut di buat sesuai dengan format Lembar Kerja Mahasiswa yang telah di sediakan,
kemudian di submit ke https://elearning.unsri.ac.id
 Daftar Pustaka
Sukaryawan, Made dan Diah Kartika Sari. (2023). Buku Ajar Biokimia 1 Metabolisme Berbasis
Kontruktivisme 5 Fhasa Needham. Palembang: Bening Media Publishing