4th GROUP

Transformasi Tanaman 1
Isolasi gen; primer; amplifikasi; kloning gen: pemilihan vektor;
Gen penanda (resistan antibiotik), gen pelapor (GUS, GFP)
 PART OF US

Aqilla Nur Fadia Misbahatul Ishlah Sheikha Fakhrun Vissa

11190950000087 11190950000088 11190950000095
TABLE OF CONTENTS
01 02 03 04
Transformasi Isolasi Primer Amplifikasi
Genetik gen
Tanaman
05 06 07 08

Kloning Pemilihan Gen Gen

gen vektor Penanda Pelapor
01
Transformasi
Genetik
Tanaman
Transformasi genetik pada tanaman
adalah mentransfer gen asing yang
diperoleh dari tanaman, virus, bakteri,
hewan, atau manusia pada suatu
spesies tanaman tertentu. Atau bisa
juga dikatakan suatu proses untuk
mendapatkan tanaman transgenik.
Bertujuan untuk mendapatkan
tanaman unggul yang lebih baik dari
tanaman aslinya.
02
Isolasi Gen
Isolasi DNA merupakan serangkaian proses yang
dilakukan untuk memisahkan DNA dari komponen-
komponen sel seperti lipid, protein, dan RNA.
 TAHAPAN ISOLASI DNA GENOM

Terdiri dari 5 tahap yaitu :

1. Pemecahan membran sel : dilakukan dengan menggunakan bahan-bahan
kimia seperti detergen atau dengan menggunakan enzim
2. Penghilangan protein : Protein dan asam nukleat (DNA) berbeda
kelarutannya dalam pelarut organik
3. Penghilangan RNA : dilakukan secara enzimatik dengan menggunakan
RNase
4. Presipitasi DNA : digunakan dua jenis alkohol yaitu isopropanol dan etanol
5. Pengukuran kemurnian dan kuantitas DNA dapat mempengaruhi intensitas
pita DNA hasil amplifikasi
03
Primer
Primer adalah rantai asam nukleat yang berfungsi
sebagai titik awal untuk mensintesis DNA, yang
diperlukan untuk replika DNA karena enzim-enzim
yang mengkatalisis proses ini yaitu DNA polimerase.

Pemilihan primer pada analisis genetik berpengaruh

terhadap pita polimorfik yang dihasilkan karena
setiap primer memiliki situs penempelan tersendiri
04

Amplifikasi
Amplifikasi gen adalah peningkatan jumlah yang ada pada
salinan gen, dimana kemungkinan terjadi peningkatan RNA
dan protein yang dihasilkan oleh gen tersebut.

Amplifikasi merupakan suatu proses yang menjadikan

suatu urutan DNA tereplikasi lebih banyak daripada
proporsinya dalam molekul induknya. Gen biasanya
diamplifikasi di laboratorium untuk tujuan penelitian
 05

Kloning Gen
Kloning gen adalah proses di mana gen
yang diinginkan ditempatkan dan disalin
(dikloning) dari semua DNA yang
diekstraksi dari suatu organisme.
 Langkah-langkah Dasar Kloning Gen

1) 2)

DNA diekstraksi dari organisme Plasmid bakteri dipotong

yang diketahui, kemudian gen dengan enzim restriksi yang
yang diinginkan dipotong menjadi sama.
potongan-potongan seukuran gen
dengan enzim restriksi
Langkah-langkah Dasar Kloning Gen

3) 4)

DNA seukuran gen dan potongan

plasmid digabungkan dalam satu
tabung reaksi. Seringkali, potongan
plasmid dan potongan DNA seukuran
gen akan menyatu membentuk
plasmid rekombinan (DNA
rekombinan).
Plasmid rekombinan ditransfer
ke bakteri menggunakan
elektroporasi atau kejutan
panas (heat shock).
 Langkah-langkah Dasar Kloning Gen
Perpustakaan gen disaring
untuk mengidentifikasi koloni
Bakteri akan berlapis dan
yang mengandung gen yang
tumbuh menjadi koloni.
6) diinginkan. Penyaringan koloni
Semua koloni pada 5) dilakukan dengan mencari salah
semua lempeng disebut
satu dari 3 hal yaitu:
perpustakaan gen.
a) Urutan DNA dari gen yang
diinginkan atau gen yang
sangat mirip.
Gen resistensi antibiotik b) Protein yang dikodekan
secara alami hadir dalam 7) oleh gen yang diinginkan.
plasmid bakteri yang c) Penanda DNA yang
digunakan dalam kloning lokasinya telah dipetakan
gen. dekat dengan gen yang
diinginkan
 06
Pemilihan Vektor
Vektor merupakan plasmid atau bakteriofage
yang digunakan untuk mengintroduksi gen untuk
diklonkan ke dalam suatu sel inang yang cocok.
Secara garis besar ada 4 vektor yang digunakan
dalam proses pengklonan gen (sebagai faktor
kloning), yaitu:
- Plasmid
- Fage
-Kromosom buatan dari Khamir (YAC=yeast
aerifical chromosome)
-Kosmid
Karakteristik Penting yang Harus Dimiliki Vektor
Kloning
(1) Stabil dalam sel inang,
(2) Mengandung gen resistensi antibiotik tertentu, sehingga
memudahkan seleksi dari gen rekombinan,
(3) Memiliki titik ori (sebagai titik awal replikasi), sehingga bisa
bereplikasi atau multiplikasi sendiri. Dengan kata lain, plasmid
tersebut dapat berbiak autonom serta dapat mengontrol
replikasinya sendiri,
(4) Memiliki daerah restriksi atau MCS, yang dapat dipotong
dengan enzim restriksi endonuklease tertentu,
(5) Berukuran kecil,
(6) Dipotong pada situs tunggal oleh endonuklease restriksi,
(7) Tidak ditransfer dengan konjugasi,
(8) Cirinya dengan mudah dideteksi, dan
(9) Mudah diisolasi dari sel,
 07
Gen Penanda (Resistensi Abiotik)
Penanda resistensi antibiotik adalah penanda yang paling sering digunakan dan telah
banyak dibuat sebagai dasar untuk pengembangan teknik penanda yang lainnya.
Keuntungan dari teknik ini adalah dimungkinkan untuk menyeleksi populasi bakteri
yang hidup dari bakteri yang ditandai, dan teknik ini dapat dilakukan hanya dengan
teknik pencawanan dengan menggunakan menggunakan antibiotik yang sesuai.

Di dalam laboratorium, penanda resistensi antibiotik sering digunakan sebagai suatu

selectable marker untuk memastikan bahwa suatu bakteri dalam kultur mengandung
gen penyandi antibiotik tertentu
 08

Gen Pelapor (GUS, GFP)

Gen pelapor (report gene) merupakan gen yang dapat berperan sebagai
indikasi keberhasilan upaya cloning gen. Gen pelapor berfungsi untuk
memastikan apakah suatu gen tertentu telah tersisipi atau terekspresi dalam
populasi sel atau organisme. Gen pelapor terbagi menjadi menjadi GUS (β-
glucuronidase) dan GFP (green fluorescent protein).
 GUS (β-glucuronidase)

Gen ini banyak dipergunakan sebagai penanda pada system transformasi

tanaman dan seringkali digunakan untuk mempelajari fungsi promoter. Uji
histokimia pewarnaan gus ini memerlukan X-Gluc (5-bromo-4-cjloro-3-
indolyl-β-D-asam glukuronat), yang kemudian dengan enzim β-glukuronidase
yang dihasilkan oleh gen gus akan membentuk senyawa yang berwarna biru.
Warna biru inilah yang menandakan telah terekspresinya gen gus .
 GUS (β-glucuronidase)
Pengujian gen pelapor gus ditandai dengan munculnya bintik berwarna biru. Warna biru
yang muncul pada sel atau jaringan menunjukkan hasil transformasi positif. Warna biru
disebabkan oleh reaksi substrat X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)
dengan enzim β-glucuronidase menjadi senyawa antara yang setelah melalui reaksi
dimerisasi oksidatif membentuk senyawa dikloro-dibromoindigo (CIBr-indigo) yang
berwarna biru.

Keunggulan dari gen penanda GUS adalah gen tersebut menyanjikan β-glukurodinase
yang berfungsi dalam menguji keberhasilan transformasi dari gen yang diinginkan, namun
disisi lain, gen penanda GUS memiliki kelemahan. GUS memiliki sifat destruktif sehingga
sel yang memberikan hasil positif GUS akan mati dan tidak dapat diregenerasikan lebih
lanjut. (Husada, 2013).
 GFP (Green Fluorescent Protein)
Gen GFP (green fluorescent proteins) atau protein berpendar hijau, adalah sekelompok
protein dengan struktur yang mirip satu sama lain yang berpendar hijau apabila
disorot/dipaparkan dengan cahaya biru. Protein ini pertama kali diisolasi dari ubur-ubur
Aequorea victoria yang mampu memendarkan cahaya hijau pada tahun 1962 oleh Osamu
Shimamura. Tidak seperti GUS dan LUC, GFP memiliki keunggulan tersendiri yaitu tidak
memerlukan suatu substrat sehingga tidak bersifat toksik, maka pengambilan gambar
bisa menggunakan sel hidup (in vivo imaging).

Dalam sel dan biologi molekuler, gen GFP sering digunakan sebagai pengekspresi. Dalam
bentuk dimodifikasi, itu telah digunakan untuk membuat biosensor, dan banyak hewan
telah diciptakan yang mengekspresikan GFP sebagai bukti konsep dimana gen dapat
dinyatakan melalui organisme yang diberikan.
 GFP (Green Fluorescent Protein)
Green Fluorescent Protein (GFP) adalah protein yang terdiri dari 238 residu
asam amino memiliki berat molekul 26.9 kDa yang dapat menunjukkan
fluoresensi hijau bila terkena sinar biru. Di dalam GFP terdapat gugus yang
disebut chromophore yang berperan sangat penting dalam proses
perpendaran hijau. Chromophore terdiri dari tiga residu asam amino di posisi
65 (Serin), 66 (Tirosin), dan 67 (Glisin). Ketika dikenai energi cahaya biru atau
UV maka pada gugus ini akan terjadi reaksi oksidasi. Energi yang diserap
membuat elektron-elektron di dalam gugus ini tereksitasi dan menghasilkan
energi yang lebih rendah yaitu energi cahaya hijau
 GFP (Green Fluorescent Protein)
Beberapa penelitian telah memanfaatkan gen GFP sebagai marker pada
pelaksanaan transformasi. Bahkan beberapa hewan telah berhasil disisipi
dengan gen GFP ini sehingga dapat memendarkan warna hijau contohnya
kera, ikan, dan tikus. Sedangkan dibidang kedokteran gen GFP telah
dimanfaatkan untuk mendeteksi penderita penyakit Alzeimer. Menurut
Rahmawati (2003) gen GFP dapat dijadikan sebagai penyeleksi alternatif
untuk transformasi tanaman. Sedangkan Widayati (2008), melaporkan bahwa
dengan menggunakan gen GFP dapat mendeteksi keberadaan bakteri
diazotrof endofit dalam jaringan tebu. GFP juga telah digunakan untuk
menyelidiki proses infeksi dalam kultivar padi komersial dan diekspresikan
pada berbagai organisme seperti bakteri, cendawan, tumbuhan, serangga dan
sel mamalia.
 GFP (Green Fluorescent Protein)

Beberapa kelebihan penggunaan gen GFP menurut Ehrenberg (2008) dalam

Ratnasari (2011) sehingga banyak digunakan sebagai penanda molekuler
antara lain adalah ekpresinya dapat diamati secara langsung tanpa merusak
jaringan yang akan ditransformasikan. Keberadaan gen di dalam sel itu sendiri
tidak membutuhkan perlakukan khusus pada jaringan, tidak membutuhkan
penambahan substrat untuk visualisasinya dan ekspresi gen GFP dapat
dideteksi sampai pada tingkat sel tunggal.
7,498,300
Big numbers catch your audience’s attention
1) Konstruksi Gen OsERA1 ke Vektor Ekspresi pCambia1301
• Isolasi mRNA dan amplifikasi fragmen gen dengan
teknik PCR
• Elusi dan ligasi fragmen DNA pada Vektor pGEM®- T
Easy serta transformasi ke Escherichia coli DH5D
• Kloning gen OsERA1 ke vektor pCambia1301
2) Introduksi Gen OsERA1 ke dalam Genom Padi Model
Nipponbare Menggunakan Agrobacterium tumefaciens
3) Analisis Molekuler Tanaman Transforman Padi Nipponbare-
OsERA1
• Isolasi DNA genomik
• Analisis molekuler dengan teknik PCR
• Analisis molekuler dengan hibridisasi Southern blot
4) Pengujian Cekaman Kekeringan Padi Transgenik
Nipponbare-OsERA1 pada Fase Vegetatif dan Generatif
1) Konstruksi Gen OsERA1 ke Vektor Ekspresi pCambia1301
• Isolasi mRNA dan amplifikasi fragmen gen dengan teknik PCR
1) Konstruksi Gen OsERA1 ke Vektor Ekspresi pCambia1301
• Elusi dan ligasi fragmen DNA pada Vektor pGEM®- T Easy serta transformasi ke Escherichia coli DH5D
• Kloning gen OsERA1 ke vektor pCambia1301
2) Introduksi Gen OsERA1 ke dalam Genom Padi Model Nipponbare Menggunakan
Agrobacterium tumefaciens
3) Analisis Molekuler Tanaman Transforman Padi Nipponbare-OsERA1
Kesimpulan Gen OsERA1 telah berhasil dikonstruksi ke dalam kaset vektor transformasi pCambia1301
Jurnal dengan dikendalikan oleh promotor dan terminator 35S CaMV. Kaset vektor transformasi
pCambia1301- OsERA1 telah diintroduksikan ke dalam genom padi cv. Nipponbare dan
menghasilkan sembilan galur tanaman transgenik putatif independen generasi T0. Analisis PCR
sembilan galur tanaman transgenik putatif generasi T1 menggunakan primer spesifik me-
nunjukkan bahwa tujuh galur tanaman telah terde- teksi membawa transgen OsERA1. Analisis
Southern blot pada dua galur padi transgenik generasi T2, yaitu Nip-ERA 6 (6 tanaman) dan Nip-
ERA 18 (10 tanaman) menunjukkan gen OsERA1 terintegrasi dengan jumlah kopi sisipan transgen
bervariasi antara 1–3 kopi. Lima galur padi transgenik Nipponbare-OsERA1 generasi T1
mempunyai respon toleransi yang lebih baik terhadap cekaman kekeringan pada fase vege- tatif
dibanding dengan Nipponbare kontrol dalam hal kemampuan pulih setelah perlakuan cekaman
ke- keringan. Pada fase generatif, lima galur padi trans- genik Nipponbare-OsERA1 generasi T2
menghasilkan jumlah biji hampa yang lebih sedikit dibanding dengan kontrol setelah perlakuan
cekaman kekeringan.
“Thank You”