1.

Lembaga anda diminta oleh pemerintah daerah bali untuk memproduksi vaksin subunit
covid-19. Vaksin ini adalah vaksin sub-unit dimana protein yang dijadikan sebagai
antigen adalah Spike protein (protein S) yang terdapat pada permukaan virus SARS-CoV-
2. Sekuens Gen pengkode protein S dapat diperoleh dari GenBank
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN938387). Selanjutnya Lembaga anda
mensintesis gen pengkode protein S dan memperbanyaknya dengan PCR. Setelah gen
sisipan didapatkan maka anda diminta untuk mengkloning gen pengkode protein S pada
host E.coli. Bagaimanakah tahapan-tahapan yang anda lakukan untuk mengkloning gen
pengkode protein S ke dalam host E.coli TOP 10 jika anda diberikan alat dan bahan
sebagai berikut : Plasmid pGEM-T, Enzim endonukleaserestriksi EcoRI, Enzim ligase,
IPTG, CaCl2, heater dan box pendingin, Kultur bakteri E.coli TOP 10, X-gal, Ampicilin,
media pertumbuhan, gel agarose, alat elektroforesis DNA, alat sekuensing, alat-alat gelas
dan incubator (45 poin).

Jawab:

Secara umum kloning fragmen DNA mencakup langkah strategi kloning seperti
dibawah. Tahapan kloning gen pengkode protein S ke dalam host E.coli TOP 10 adalah
sebagai berikut:
1. Penyiapan DNA
Pada tahap ini dilakukan penyiapan DNA sisipan (gen insulin, gen T-PA, gen
hormone pertumbuhan, dan lain-lain) serta plasmid (ekspresi, cloning) dengan enzim
endonuclease restriksi. Isolasi fragmen DNA agar lebih spesifik dapat dilakukan dengan
metode P. Penyapan yang dilakukan seperti:
 Penyiapan Plasmid pGEM-T dari bakteri E.coli yang telah disisipkan gen yang
resisten terhadap antibiotik ampicilin.
 Dilakukan pemotongan plasmid pGEM-T menggunakan enzim endonukleaserestriksi
EcoRI pada urutan kode genetik yang sesuai.
 Disiapkan gen pengkode protein S untuk DNA sisipan

2. Ligasi DNA
Ligasi untuk melekatkan potongan-potongan DNA dalam sekuens yang diinginkan.
Fragmen DNA dicampurkan dengan plasmid yang telah dipotong dengan enzim restriksi
yang sama. DNA ligase ditambahkan untuk mengikatkan fragmen DNA ke plasmid. DNA
sisipan (gen pengkode protein S) disisipkan dengan plasmid pGEM-T dengan menggunakan
enzim ligase sehingga menjadi DNA rekombinan.

3. Transformasi
Pada tahap ini dilakukan penyisipan DNA rekombinan ke sel inang. DNA rekombinan
dimasukkan ke dalam sel bakteri E.coli, setelah sebelumnya dilakukan thermal shock dengan
merendam bakteri pada larutan CaCl2. Setelah itu diletakkan dalam box pendingin dan
selanjutnya dimasukkan pada heater. Setelah sel bakteri menerima DNA rekombinan,
selanjutnya dilakukan cloning bakteri yang telah berisi DNA rekombinan.

4. Seleksi dan Skrining

Seleksi sel transforman yang membawa DNA rekombinan dan deteksi keberadaan dan
kebenaran DNA sisipan (ukuran dan urutan nukleotida). Skrining/seleksi: seleksi sel-sel yang
berhasil ditransfeksi dengan DNA baru. Setelah bakteri sisipan di tumbuhkan pada media
pertumbuhan dengan gel agarose, kemudian seleksi koloni bakteri dilakukan dengan cara X-
gal, kemudian hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dengan alat elektroforesis DNA dan
memperlihatkan pita fragmen DNA sisipan yang terpisah dari pita vektor cloning.
Disiapkan kultur bakteri E.coli TOP 10, selanjutnya tahap purifikasi untuk
mendapatkan protein hasil rekombinan. Pada media pertumbuhan diberikan antibiotik
ampicillin agar sel kultur yang mengandung DNA rekombinan saja yang dapat tumbuh pada
media tersebut. Selanjutnya dilakukan tahap seleksi dengan menggunakan X-gal dan IPTG
untuk dapat membedakan sel kultur dengan perbedaan warna yaitu warna biru atau putih.
Konfirmasi ukuran dilakukan dengan menentukan ukuran gen menggunakan alat
elektroforesis DNA dan menentukan urutan DNA dengan sekuensing. Selanjutnya sel kultur
yang dipilih diinkubasi dalam inkubator untuk memperbanyak sel kultur sehinggsa
didapatkan protein hasil rekombinan yang sesuai dalam jumlah yang besar.

2. Human Epidermal Growth Factor/hEGF (Heberprot-P) merupakan protein rekombinan

yang berfungsi untuk terapi kaki pasien diabetes yang mengalami ulcer. Protein hEGF
bukan merupakan glikoprotein, merupakan protein intrasel berukuran 6 kDa dengan 53
asam amino. Protein hEGF merupakan 1 polipeptida dengan struktur tersier globular dan
3 ikatan disulfide, muatan total positif, hidrofobik dan pI berada pada pH 8.7. Protein ini
juga telah direkayasa untuk membawa ekor histidin (his tag). Protein tidak stabil dalam
 larutan berair dan dibuat dengan bahan tambahan manitol, sukrosa dan polysorbate. Pilih
dan jelaskan strategi upstream dan downstream processing yang akan anda gunakan untuk
memperoleh sediaan hEGF
a. Host apa yang anda gunakan?
b. Sistem fermentor atau bioreactor yang anda gunakan?
c. Pemisahan protein (intrsel atau ekstrasel),
d. Pemurnian protein (pilihlah multistep atau one step)
e. Formulasi protein (larutan atau kering)

Jawab:

Strategi upstream dan downstream processing yang akan digunakan untuk

memperoleh sediaan hEGF:

a. Host yang digunakan adalah E. coli

b. Sistem fermentasi yang digunakan adalah Microbial Fermentor (anaerob/mikroba) karena
metode ini menggunakan host bakteri Escherichia coli.
c. E. coli merupakan golongan prokariotik, sehingga pemisahan protein yang digunakan
adalah pemisahan protein intrasel. Pemisahan protein intrasel dilakukan dengan cara
sentrifugasi untuk melisikan sel.
d. Pemurnian protein dilakukan dengan cara One Step Protein Purufication karena protein
yang didapatkan telah direkayasa dengan penambahan histidin tag (his tag) untuk
memudahkan proses downstream processing.
e. Formulasi protein yang digunakan dalam bentuk serbuk dengan metode freeze drying
karena protein ini tidak stabil dalam larutan berair. Penggunaan bahan tambahan manitol,
sukrosa, dan polysorbate sebagai eksipien sediaan hEGF.