Rangkuman Biotek (Setelah UTS)

DNA Rekombinan

DNA rekombinan atau rDNA adalah suatu bentuk DNA buatan yang dibuat dengan cara
menggabungkan atau merekombinasi dua atau lebih untaian benang DNA yang dalam keadaan
normal tidak berpasangan atau terjadi bersama. [1] Pada bahasan biologi molekuler, modifikasi
genetik dilakukan dengan memasukkan DNA yang relevan ke dalam DNA organisme yang hidup
misalnya pada plasmid bakteri, untuk menyandikan suatu sifat khusus tertentu seperti antibiotik dan
sifat lain.[1] Hal ini berbeda dengan konsep DNA rekombinan yang kombinasi DNAnya tidak terjadi
secara alami di dalam sel tetapi direkayasa.[1] Proses rekombinasi DNA yang umum dilakukan adalah
dengan menggabungkan untaian DNA dari dua organisme yang berbeda. [2] Bergabungnya dua DNA
dari organisme yang berbeda misalnya pada suatu plasmid bakteri dibantu oleh enzim ligase.[3]
Teknologi DNA rekombinan melalui teknik pemotongan DNA merupakan salah saktu bukti penguat
yang menunjukkan bahwa DNA adalah suatu unit pewarisan.

Dalam dunia kesehatan, produk komersial pertama yang dihasilkan dengan teknologi DNA
rekombinan adalah insulin. Penelitian dan proyek insulin ini dimulai sebelum peraturan dan
kebijakan pemerintah tentang pemanfaatan secara luas dan komersial tentang DNA rekombinan
dibuat. Ketika penelitian dasar teknologi DNA rekombinan terus dilakukan untuk mencari efisiensi
dan manfaat bagi umat manusia, pemanfaatan secara komersial produk-produk yang dihasilkan dari
teknologi ini dikendalikan oleh perilaku pasar dan modal-modal investasi yang diberikan.

Kloning gen yaitu suatu prosedur inti dalam teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika untuk
memperoleh replika yang sama dari sel atau organisme tunggal.

Tahapan Kloning

1.Penyiapan DNA sisipan/ DNA target

a.Isolasi DNA

3 Penghancuran sel (lisis)

3 Ekstraksi atau pemisahan DNA
3 Presipitasi DNA
3 Pemurbiab DNA (Purifikasi)

b.Retriksi DNA  menggunakan endonukleotida

c.PCR

2.Enzim Restriksi =digunakan untuk memotong DNA, Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA
pada sekuens spes ifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa,

•Berasal dari bakteri yang resisten terhadap bacteriophage

•Endonuclease : memotong di bagian dalam DNA

Memotong DNA pada

•urutan spesifik = urutan pengenalan (recognition sequence) = sisi restriksi  palindrome

3.Vektor= Vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat
bakteri. Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular
atau DNA yang berbentuk lingkaran.
•Molekul DNA yang:

•dapat bereplikasi sendiri di dalam sel

•dapat disisipkan DNA asing

•Sudah dimodifikasi sesuai kebutuhan

•Vektor-vektor kloning yang ada dapat berupa derivat dari:

•plasmid

•virus

•kombinasi dari plasmid dan virus

Vektor kloning

- Ori untuk bereplikasi

- MCS (Multiple Cloning Site) untuk menyisipkan DNA asing

- Selectable Marker untuk menentukan proses ligasi berhasil atau tidak

4.Ligasi= digunakan untuk m enyambung DNA, mereka berhasil menggabungkan fragmen-fragmen

DNA dengan cara memasangkan (anneal) ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky
ends fragmen lainnya, kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara
kovalen dengan menggunakan enzim DNA ligase.

5.Transformasi= Memasukkan DNA kedalam sel bakteri. campuran kedua bentuk plasmid ini
kemudian dicampurkan dengan kumpulan sel-sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid.

Transformasi :

–Memasukkan DNA ke dalam sel

–Sel ditransformasi oleh DNA

–DNA mentransformasi sel

•Sel yang telah ditransformasi Transforman

•Efisiensi transformasi = Jumlah transforman / mikro g DNA

•Metode : Metode CaCl2, Elektroporasi, Metode LiAc/ssDNA/PEG, Metode liposom, Balistik biologis

Kompeten dan heart shock

1. Kultur e coli  disentifugasi  campurkan resuspen bakteri dalam larutan CaCl2  Dinginkan di
atas es  sel kompeten Aliquot 4 tabung  simpan pada 80 derajat C  masukan DNA Plasmid 
dinginkan diatas es batu  heat shock  masukan ke air 42 derajat C  piring di LB + ampicillin 
106 -108 coloni/migro g DNA

6.Seleksi klon= Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan

7.Sekuensing= Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan
basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA, yang
merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang
dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup.[1] Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk
menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan
sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.

MANIPULASI GEN
Ekspresi gen

• Sistem ekspresi gen terdiri dari kombinasi vektor

dan sel inang

• Pilihan sistem ekspresi berdasarkan

• Gen target

• Jumlah yang akan diproduksi

• Tujuan produksi

Transkripsi (DNA  mRNA Ribosome) terjadi di nukleus

Translasi (mRNA ribosom  Polipeptide) diluar nukleus

Organisasi Gen prokariot

Komponen transkripsi : promoter, terminator, situs inisiasi transkripsi

Komponen translasi : RBS, kodon start, kodon stop

Strategi everproduksi

 Penggunaan promotor kua

 Pemilihan Vektor
 Pemilihan sel iinang

Regulasi ekspresi DNA Sisipan

• Penggunaan promotor kuat

• Promotor dan terminator dikenali oleh RNA Polimerase inang
• Ekspresi gen perlu diregulasi → promotor

Vektor (Plasmid)

• Vektor Kloning  Mendapatkan DNA (copy number tinggi)

• Vektor Ekspresi  Mendapatkan protein (tambahan komponen untuk mempermudah proses
pemurnian)

Vektor Shuttle  • Vektor yang dapat replikasi dalam dua inang, • Mempunyai dua ori

Vektor Ekspresi Eukariot 

• Satuan transkripsi

–Promoter (p)

–Sisi kloning (MCS)

–Sinyal terminasi transkripsi & poliadenilasi (t)

• Marker seleksi

–eukariot (ESM)

–E. coli (Ampr)

• ori

–E. coli

–Eukariot

Pemilihan Inang

• Pemilihan tergantung pada:

- Jenis dan jumlah protein yang akan dihasilkan

- Modifikasi struktur protein

- Biaya produksi

• Faktor-faktor yang harus diperhatikan:

1. Pola pertumbuhan

2. Biaya pertumbuhan

3. Tingkat ekspresi

4. Sekresi produk (memudahkan pemurnian)

5. Ketersediaan vektor dan vektor shuttle

Modifikasi Pasca Translasi pada protein eukariot

- Pemotongan oleh protease

- Glikosilasi:

• Terjadi pada 30 % protein mamalia

• Stabilitas protein

• Sifat ikatan tertentu dari protein

• Glikosilasi O : pada gugus OH dari Ser, Thr

 • Glikosilasi N : pada gugus amida dari Asn

- Fosforilasi
- Asetilasi
- Penambahan S
- Asilasi
- y-karboksilasi
- Penambahan asam lemak C14 & C16

Organisme inang

 Sel Prokariot
• Manipulasi mudah
• Biaya produksi rendah
• Ekspresi gen eukariot tingkat tinggi:
– Kadang-kadang protein inaktif
– Kesalahan pelipatan protein
– Kesalahan modifikasi pasca-translasi

Contoh

• Bacillus subtilis : Protein intaseluler atau ekstraseluler

• Escherichia coli : Terkarakterisasi dengan baik (pertumbuhan dan genetik), Protein
dalam sitoplasma atau ruang periplasmik, Kodon tidak optimal untuk beberapa gen
 Eukariot
• Mudah dimanipulasi sepertiE. coli
• Biaya produksi murah, metode kultur sudah baku
• Sudah lama digunakan dalam proses fermentasi
• Aman: bebas dari endotoksin
• Protein intra & ekstraseluler
• Tingkat rekombinasi tinggi
Produksi
• Tidak stabil
– Pelipatan protein salah
– Tidak terjadi modifikasi pasca translasi
• Tidak aktif
• Pirogenik
• Dikembangkan sistem ekspresi pada ragi, serangga, mamalia untuk produksi:
– Agen terapeutik yang tidak terkontaminasi
– Protein aktif untuk studi biokimia, biofisika & struktur
– Protein untuk proses industri

Contoh

– Ragi

• Saccharomyces cerevisiae

• Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

• Pichia pastoris

• Schizosaccharomyces pombe
– Fungi berfilamen

• Aspergillus

– Tumbuhan

• Pisang

– Hewan

• Sel mamalia

• Sel serangga

Perbedaan Sistem Prokariot dan Eukariot

Prokariot

• Jumlah protein (Tinggi)

• Medium sederhana

• Pertumbuhan (Cepat)

• Modifikasi pasca translasi tidak ada

• Ukuran protein (Kecil)

• Konformasi protein sederhana

• Kecenderungan pembentukan badan inklusi

• Tidak mampu menghilangkan intron

Eukariot

• Jumlah protein (Sedikit)

• Medium kompleks

• Pertumbuhan (Lambat)

• Modifikasi pasca translasi ada

• Ukuran protein (Besar

• Konformasi protein kompleks

• Tidak ada kecenderungan pembentukan badan inklusi

• Mampu menghilangkan intron

PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN

1. Satukan gen resistensi antibiotik dengan fragmen DNA
2. Akan terbentuk Hibridisasi dengan DNA ligase
3. Kemudian ditransformasi (sel bakteri dan kromosom bakteri)
4. Kemudian di klon (perbanyak)
5. Masukan ke media + antibiotik
6. Bakteri yg mengandung DNA rekombinan tumbuh
7. Kemudian di kultur untuk memperbanyak bakteri
8. Isolasi dan pemurnian DNA rekombinan

Isolasi dan pemurnian protein

1. Sumber protein (mikroba, tanaman, hewan) 

2. Protein intraseluler
a. Isolasi sel
b. Pemecahan sel
c. Pemisahan serpihan sel
d. Pemekatan protein
3. Protein ektraseluler
a. Pemisahan sel
b. Pemekatan protein
4. Kromatogragi kolom

Isolasi protein intrasel

• Protein yang terdapat dan bekerja di dalam sel

1. Isolasi : memecah sel

- Enzimatis : lisozim, litikase (struktur dinding sel)
- Kimia : deterjen (mengganggu permeabilitas dinding sel)
- Fisika : sonikasi, homogenisasi, penggerusan → Sentrifugasi
2. Sehingga supernatan (protein terlarut) dan debris sel terpisah
3. Sentrifuga (pelet sel diambil)
4. Sel disuspensi
5. Dalam volume kecil di sonikasi (pemecahan sel)
6. Sentrifugasi (supernatan diambil)
7. Dalam volume besar
8. Pekatkan dengan ultrafiltrasi.fraksinasi

Pemekatan Protein

• Pengendapan protein dalam larutan garam netral konsentrasi tinggi-SALTING OUT

• Amonium sulfat

Pemurnian Protein

Faktor Penentu

• Tingkat kemurnian → tujuan penggunaan terapeutik dan diagnostik kemurnian tinggi

• Proses pemurnian → sifat alamiah bahan baku, tingkat kemurnian protein

Prinsip

1. Protein dimasukkan kedalam kolom (protein target akan terikat pada matriks)
2. Pencucian untuk menghilangkan protein lain yang tidak diinginkan
3. Elusi untuk melepaskan protein target dari matriks kolom
 Prosedur

a. Gel difitrasi dengan kromatografi

b. Pertukaran ion kromatografi
Pemurnian 1.000 – 10.000 x
Protein rekombinan: Hexa-His: mengikat ion logam (Ni2+, Cu2+
GST (glutation S- transferase): mengikat glutation
c. Afinitas Antibodi  kekuatan interaksi antara antigen dan antibodi

Konsentrasi proteinsel

1. Spektrofotometri UV (OD280)

Berdasarkan serapan pada asam-asam amino aromatik

2. Kolorimetri (Metode Lowry)

Berdasarkan reaksi biuret protein dengan copper(II) dan reduksi Folin cioucalteu
phosphomolybdic-phosphotungstic

Karakterisasi protein

a. Bobot molekul (SDS-PAGE)

SDS terikat pada bagian hidrofobik dari protein
• Protein terdenaturasi
• Muatan protein menjadi negatif
b. Muatan (Isoelectric focusing)
c. Reaksi Imunikimia (Western blot)

ANALISA PRODUK FARMASI BERBASIS BIOTEKNOLOGI

Analisa Protein

• Penentuan kadar

• Penentuan urutan asam amino

• Elektroforesis (SDS-PAGE, PAGE native, Elektrofokusing, dan Elektroforesis dua dimensi)

• Western Blot

Analisa Asam Nukleat

• Sekuensing

- Penentuan struktur primer (atau sekuens primer) rantai biopolimer tak bercabang
- Teknik untuk menentukan urutan basa nukleotida dari urutan suatu DNA
- Metode Sanger

• Hibridisasi (Southern Blot, Northern Blot)

- Southern Blot
• Teknik untuk mendeteksi urutan DNA tertentu
• Menggunakan enzim restriksi untuk memotong sampel DNA menjadi fragmenfragmen
yang dipisahkan menggunakan elektroforesis gel.
 • Fragmen DNA ditransfer dari gel ke permukaan membran.
• Membran dihibridisasi dengan probe DNA yang dilabeli tag radioaktif atau kimia.
• Jika probe mengikat membran, maka urutan probe terdapat dalam sampel.
- Northern Blot
• Teknik untuk mendeteksi urutan RNA spesifik
• Molekul RNA dipisahkan menggunakan gel elektriforesis dan ditransfer ke permukaan
membran
• Membran dihibridisasi dengan probe DNA yang dilabeli tag radioaktif atau kimia.
• Jika probe mengikat membran, maka urutan probe terdapat urutan RNA yang komplementer

Biofarmaseutik

• Obat yang dibuat menggunakan bioteknologi dengan melibatkan organisme hidup dan
bioproses
• Biofarmaseutika rekombinan umumnya menggunakan bioteknologi molekuler yang
melibatkan rekayasa genetika
• Contoh :
– Protein → Natif dan rekombinan
– Terapi gen → Asam nukleat (DNA atau RNA)
– Terapi sel → Terapi sel somatik, terapi sel punca

Produk protein terapeutik  insulin

Metode Produksi Protein Terapeutik

1. Sel manusia dicampurkan gen untuk hormon pertumbuhan manusia (E-coRI)

2. Sel bakteri (plasmid dan Kromosom) disatukan deng E-coRI
3. Sehingga disatukan dgn tahap 1  Rekombinan DNA
4. Ditambahkan gen untuk hormon pertumbuhan manusia
5. Penyisipan DNA
6. Sel bakteral yang mengandung gen untuk pertumbuhan bakteri

Alur produksi Protein terapeutik

1. Isolasi DNA
2. Konstruksi Plasmid Rekombinan
3. Sel Inang (Ekspresi)
4. Kandidat Bank Sel
5. Karakterisasi Bank Sel
6. Produksi Protein
7. Purifikasi Protein
8. Karakterisasi Protein
9. Formulasi
10. Evaluasi Produk
11. Spesifikasi Produk Jadi
12. Spesifikasi Bahan Baku

Klasifikasi Protein Terapeutik

1. Protein dengan aktivitas regulasi/enzimatik

2. Protein dengan aktivitas penargetan spesifik

3. Protein vaksin :

- Vaksin preventif

- Vaksin kuratif

Protein dengan aktivitas regulasi

• Protein yang menggantikan defisiensi protein atau protein abnormal, contoh : Insulin

• Protein yang mendorong jalur yang telah ada, contoh : Eritropoietin (Epo)

• Protein dengan fungsi atau aktivitas baru, contoh : toksin botulinum

Protein dengan aktivitas spesifik

Antibodi monoklonal : antibodi monospesifik yang hanya mengikat satu epitop, yaitu komponen
antigen yang dikenali oleh sistem imun (antigen determinan) sehingga antibodi monoklonal dapat
mengenali dan mengikat antigen yang spesifik.

Protein Vaksin

Menurut FI IV :

Vaksin adalah sediaan yang mengandung zat antigenik yang mampu menimbulkan kekebalan

aktif dan khas pada manusia. Vaksin dapat dibuat dari bakteri, virus dan dapat berupa suspensi
organisme hidup atau inaktif atau fraksifraksinya atau toksoid.

Jenis Jenis Vaksin

•Generasi pertama: mengandung mikroorganisme hidup yang dilemahkan

• Generasi kedua: mengandung mikroorganisme yang dimatikan

• Generasi ketiga: dikenal sebagai vaksin rekombinan atau sub unit, mengandung fragmen antigenik
dari mikroorganisme yang dapat merangsang respon imun

• Generasi keempat: Vaksin DNA

Regulasi Biosimilar

• Biogenerik ≠ obat generik

• Produk biologi = struktur menentukan aktivitas/imunogenitas, struktur dipengaruhi proses

produksi

• Tidak mungkin meniru produk yang identik bila proses pembuatan tidak sama (rahasia
perusahaan?) → biosimilar

• Produk biosimilar tetap harus diuji aktivitas & keamanan (uji klinik tahap I, II, III) ≠ obat generik
(cukup uji bioekivalensi)

• Biogenerik harus mencantumkan proses pembuatan (metode, sistemekspresi, inang)

• Tidak ada peraturan yang umum, tergantung jenis produk

Target Biosimilar Tipe 1

• EPO (eritropoietin)

• CSF (colony stimulating factor)

• hGH (human growth hormon)

• Insulin

• Vaksin Hepatitis B

• Faktor VIII

• IFN (interferon)

Biobetter

• Memiliki asam amino yang berbeda hasil dari protein engineering

• Memiliki efikasi dan keamanan yang lebih baik dari produk sebelumnya.

• Rute pemberian dan dosis yang diberikan dapat berbeda dengan produk sebelumnya

Pembuatan insulin

Insulin ini diperoleh dengan mencangkokkan gen (transplantasi gen) yang mengkod insulin ke dalam
plasmid bakteri. Bakeri dengan gen gabungan ini dbiarkan ini dibiarkan membiakkan diri. Bakteri
yang dibiakkan tersebut dapat memproduksi insulin.

Namun, ketika kalenjar pankreas mengalami gangguan sekresi gunamemproduksi hormon insulin,
disaat inilah tubuh membutuhkan hormoninsulin dari luar tubuh, dapat berupa obat buatan manusia
atau dikenal juga sebagai sebutan insulin eksogen. Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit
seperti diabetes mellitus.

Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu yang
mempelajari pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul
DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkan terjadinya integrasi dan mengalami
perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

Teknik DNA rekombinan meliputi isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggabung DNA dan
teknik untuk memasukan DNA kedalam sel hidup. Ada tiga faktor utama :

 Vektor, adalah pembawa gen asing yang akan disisipkan, biasanya berupa plasmid. Plasmid
diambil dari bakteri dan disisipi dengan gen asing.
 Bakteri, untuk memperbanyak plasmid. Makin banyak plasmid yang direplikasi makin banyak
pula gen asing yang dicopy sehingga terjadi cloning gen.
 Enzim, untuk memotong dan menyambung plasmid. Enzim ini disebut enzim endonuklease
restriksi, yaitu enzim endonuklease yang dapat memotong ADN pada posisi dengan urutan
basa nitrogen tertentu. Enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk
menggabungkan ujung sambungan (splice) dari vektor dan DNA donor, untuk membentuk
suatu vektor rekombinan.
Draf buku

Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan
dalam berbagai cara untuk menghasilkan sejumla besar protein, memodifikasi urutan gen dan
memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan
dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan
adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein rekombinan.

Protein rekombinan merupakan protein yang diperoleh dari hasil teknologi DNA
rekombinan. Kemajuan teknologi DNA rekombinan telah mendorong berkembangnya
berbagai metode produksi protein rekombinan menggunakan inang yang aman dan relatif
mudah dikultur sehingga protein dapat diproduksi pada skala industri. Sebagian besar enzim
yang digunakan untuk proses industri merupakan hasil rekayasa, baik rekayasa pada tingkat
genetik maupun protein. Melalui teknologi DNA rekombinan dapat dilakukan pemindahan
gen pengode enzim/protein dari satu organisme ke organisme lain. Sehingga bila
enzim/protein tersebut diidentifikasi sebagai kandidat enzim untuk digunakan dalam industri,
gen pengode enzim/protein tersebut dapat dikloning dalam suatu mikroorganisme inang yang
cocok, dan diproduksi dalam skala industri. Dengan cara ini produksi enzim industri dengan
kualitas dan kemurnian yang tinggi dapat dilakukan.

Protein yang digunakan untuk bidang farmasi dan kedokteran (protein terapeutik dan
vaksin) juga telah diproduksi secara rekombinan. Biopharmaceutical diistilahkan untuk obat-
obatan yang merupakan protein rekombinan, vaksin rekombinan dan antibodi monoklonal.
Protein yang digunakan untuk kepentingan pengobatan dan terapi ini disyaratkan mempunyai
kemurnian yang tinggi. Teknologi DNA rekombinan juga telah menyediakan berbagai
strategi untuk meningkatkan produksi dan mempermudah pemurnian protein. Salah satu
contoh penggunaan teknologi produksi enzim rekombinan adalah produksi enzim detergen
Lipolase oleh Novo Nordisk A/S, yang mempercepat pembuangan lemak yang tertinggal
pada kain. Enzim ini pertama kali diidentifikasi pada jamur Humicola languinosa dengan
jumlah yang tidak cukup untuk produksi komersial. Fragmen DNA dari gen pengode enzim
ini dikloning dalam jamur Aspergillus oryzae sehingga dapat diproduksi secara komersial.
Enzim ini terbukti efisien pada berbagai kondisi pencucian pakaian. Enzim ini juga stabil
pada beberapa variasi suhu dan pH, serta resistan terhadap proteolysis.

Sistem ekspresi protein yang sudah umum digunakan pada umumnya berbasis sel,
yang merupakan satu paket yang terdiri dari vektor ekspresi, DNA yang dikloning dan sel
inang, sehingga gen asing dapat 3 diekspresikan oleh sel inang dan diproduksi dalam jumlah
banyak. Ekspresi protein asing biasanya dirancang supaya terjadi dalam jumlah besar
sehingga diistilahkan overekspresi. Terdapat beberapa cara untuk memasukkan DNA asing
ke dalam sel untuk ekspresi protein, dan terdapat beberapa sel inang yang dapat digunakan
untuk ekspresi protein rekombinan.

Masing-masing sistem ekspresi memiliki keunggulan yang berbeda. Sistem ekspresi

pada umumnya melambangkan inang dan vektor pembawa materi genetik yang dipakai.
Sebagai contoh, inang yang umum digunakan adalah bakteri (seperti E. coli, B. substilis), ragi
(seperti S. cerevisiae, P. pastoris), atau sel eukariota. Sedangkan vektor pembawa yang umum
digunakan adalah virus (seperti baculovirus, retrovirus dan adenovirus), plasmid, kromosom
artifisial dan bakteriofaga (seperti lambda). Pemilihan sistem ekspresi tergantung pada gen
yang akan diekspresikan, contohnya S. cerevisiae sering digunakan untuk protein yang
membutuhkan modifikasi pascatranslasi dan sel serangga atau mamalia digunakan bila
diperlukan pemrosesan mRNA. Sedangkan sistem ekspresi bakteri memiliki keunggulan
karena dapat memproduksi protein dalam jumlah besar yang dibutuhkan untuk penelitian
penentuan struktur protein dengan X-ray crystallography atau NMR (Nuclear Magnetic
Resonance).

Konstruksi sistem ekspresi protein heterolog menggunakan strategi biologi molekul

penting dilakukan untuk investigasi rekayasa protein dan enzimologi. Hal ini terutama
menjadi masalah bila protein tersebut jarang dan sulit didapatkan dalam jumlah yang cukup
untuk penelitian fisikokimia atau bila sejumlah protein yang diinginkan akan dimutagenesis
untuk keperluan penelitian ataupun komersial. Untuk memperoleh protein yang diinginkan
dalam jumlah besar, maka sistem ekspresi yang sesuai dan kondisi optimum untuk ekspresi
harus ditentukan.

Sistem ekspresi prokariota biasanya digunakan untuk memproduksi protein heterolog

(rekombinan) dari cDNA eukariota yang dikloning. Akan tetapi pada beberapa penelitian,
protein yang disintesis oleh bakteri tersebut tidak stabil atau tidak punya aktivitas biologi.
Selain itu, meskipun kita menggunakan prosedur pemurnian protein yang sangat hati-hati,
senyawa yang bersifat toksin pada bakteri dan senyawa yang menyebabkan kenaikan
temperatur tubuh manusia dan binatang (pirogen) mungkin dapat mengontaminasi produk.
 Kuis Sesudah UAS

DNA Rekombinan

1. Lisis sel, ekstraksi, dan purifikasi DNA adalahh tahapan utama dari
a. Transformasi
b. Ligasi
c. Isolasi
d. Seleksi
2. Bagaimana plasmid yang berfungsi untuk perbanyakan diri dengan cara reflikasi adalah
a. LacZ
b. Ampr
c. Multiple Cloning Site
d. Ori
3. Hasil positif diperoleh bila mendapat pertumbuhan koloni putih yang menunjukan
a. Tidak adanya insert
b. Insert terligasi pada vektor
c. Vektor religasi
d. Insert self irigation
4. Jika tidak terdapat pertumbuhan koloni pada hasil Blue-White screening disebabkan …
a. Tidak adanya insert
b. Vektor religasi
c. Insert self irigation
d. Insert terligasi pada vektor
5. Tahapan kloning untuk konfirmasi urutan CAN sesuai gen target…
a. Sekuensing
b. Transformasi
c. Ligasi
d. Seleksi ion
6. DNA rekombinan dibuat melalui tahap isolasi, restriksi, ligasi, transformasi, seleksi dan
dikonfirmasi urutan DNA nya melalui sekuensing
7. DNA target hasil isolasi bisa didapatkan dengan cara perbanyakan in vitro melalui teknik PCR
atau pemotongan menggunakan enzim endonuklease yang akan mengenali daerah spesifik
yang bersifat palindrom
8. Vektor yang digunakan harus memiliki ori, MCS dan marker seleksi
9. Plasmid dan vektor kemudian digabungkan dengan bantuan enzim ligase sehingga
menghasilkan plasmid rekombinan, setelah itu dimasukkan ke dalam sel bakteri melalui
proses transformasi menggunakan metode heat shock

MANIPULASI GEN

1. Ekspresi gen terdiri dati proses transkripsi yang menghasilkan MRNA dan translasi yang
menghasilkan protein
2. Vektor kloning bertujuan untuk mendapatkan DNA sehingga bersifat copy number tinggi,
sedangkan vektor ekspresi bertujuan untuk mendapatkan protein sehingga memiliki
komponen tambahan untuk pemurnian
3. Vektor shuttle memilihi dua ori sehingga dapat bereplikasi pada dua organisme
4. Jelaskan secara singkat bagianbagian pada vektor ekspresi eukariot!
• Satuan transkripsi
–Promoter (p)
–Sisi kloning (MCS)
–Sinyal terminasi transkripsi &
poliadenilasi (t)
• Marker seleksi
–eukariot (ESM)
–E. coli (Ampr)
• ori
–E. coli
–Eukariot