KULIAH - 6

Manipulasi Ekspresi Gen

Nur Asni Setiani

Sekolah Tinggi Farmasi Indonesia

Ekspresi Gen

Organisasi gen prokariot

Komponen transkripsi : promoter, terminator, situs inisiasi transkripsi

Komponen translasi : RBS, kodon start, kodon stop

Vektor (Plasmid)
Vektor Kloning
Hanya untuk mendapatkan DNA (copy number
tinggi)

Vektor Ekspresi
Untuk mendapatkan protein (tambahan komponen
untuk mempermudah proses downstream/pemurnian)

Penggunaan sistem ekspresi gen pada

bioteknologi
Sistem ekspresi gen
terdiri dari kombinasi sel
inang dan vektor

Penggunaan sistem
ekspresi
Penelitian akademik
Aplikasi industri
Produksi obat
Produksi enzim
Terapi gen

Masing-masing sistem
ekspresi mempunyai
kelebihan dan kekurangan
Pilihan sistem ekspresi
berdasarkan
Gen target
Jumlah yang akan
diproduksi
Tujuan produksi

Macam-macam organisme inang

Eukariot

Prokariot
Escherichia coli
Bacillus subtilis

Ragi
Saccharomyces cerevisiae
Hansenula polymorpha (Pichia angusta)
Pichia pastoris
Schizosaccharomyces pombe
Fungi berfilamen
Aspergillus
Tumbuhan
pisang
Hewan
Sel mamalia
Sel serangga
Domba, sapi
6

Sel prokariot
Manipulasi mudah
Biaya produksi rendah
Ekspresi gen eukariot
tingkat tinggi:
Kadang-kadang protein inaktif
Kesalahan pelipatan protein
Kesalahan modifikasi pascatranslasi

Bacillus subtilis
Protein intaseluler atau
ekstraseluler

Escherichia coli
Informasi genetik banyak diketahui
Pertumbuhan sudah
terkarakterisasi dengan baik
Pengalaman penggunaannya sudah
banyak
Protein dalam sitoplasma atau
ruang periplasmik
Tidak selalu merupakan organisme
yang terbaik
Kodon tidak optimal untuk
beberapa gen

Vektor ekspresi ragi

Seleksi transforman
Vektor mempunyai gen yang mengkomplementasi gen
termutasi pada sel inang
Sel inang yang digunakan:
Mutan auksotrof
Tumbuh dalam medium minimal yang ditambahkan dengan asam
amino/nukleotida yang tidak dapat dihasilkan sel

Ekspresi
Gen diberi promoter ragi
Ekspresi maksimal bila terminasi transkripsi efisien

Vektor ekspresi ragi

Mudah dimanipulasi seperti E. coli

Biaya produksi murah, metode kultur sudah baku
Sudah lama digunakan dalam proses fermentasi
Aman: bebas dari endotoksin
Protein intra & ekstraseluler
Tingkat rekombinasi tinggi

Ragi (Saccharomyces cerevisiae) sebagai sel

inang untuk ekspresi protein eukariot

Sel tunggal
Genetika & fisiologinya banyak dipelajari
Mudah ditumbuhkan dalam skala kecil dan skala besar
Banyak promoter kuat
Plasmid alami 2 m
Dapat melakukan modifikasi pasca translasi
Protein ekstraseluler sedikit
Aman untuk agen terapeutik
Informasi genetik banyak diketahui dibandingkan sel eukariot lain
Tidak dapat melakukan splicing eukariot tingkat tinggi

Kelemahan produksi protein dalam

S. cerevisiae
Ekspresi rendah
Hiperglikosilasi dengan > 100 residu mannosa pada
glikosilasi N
Fungsi protein berubah
Protein menjadi antigenik

Pada densitas sel tinggi

dibentuk etanol yang toksik bagi sel

jumlah protein yang disekresi menurun

Keuntungan produksi protein dalam Pichia

pastoris
Promoter gen alkohol oksidase (AOX1)
Tidak ada metanol: promoter inaktif
Ada metanol:
promoter aktif
Produksi protein tinggi: mencapai 30 % protein sel

Tidak mensintesis etanol

Dapat ditumbuhkan menjadi densitas sel yang tinggi

Protein ekstraseluler sedikit

Mempermudah pemurnian protein heterolog ekstraseluler

Dihasilkan protein heterolog yang:

Dapat melakukan modifikasi pasca translasi yang kompleks
Protein dari bakteri, fungi, invertebrata, tumbuhan, hewan dan manusia
aktif
Identik dengan protein asal (autentik)

Schizosaccharomyces pombe
Sistem ekspresi gen mirip sel eukariot tingkat tinggi
Dapat melakukan splicing eukariot tingkat tinggi

Sel hewan
Hasil ekspresi gen eukariot tingkat tinggi selalu
aktif
Manipulasi tidak mudah
Produksi rendah
Biaya mahal
Sel mamalia
Masalah infeksi virus
14

Vektor ekspresi eukariot

Satuan transkripsi
Promoter (p)
Sisi kloning (MCS)
Sinyal terminasi transkripsi
& poliadenilasi (t)

Marker seleksi
eukariot (ESM)
E. coli (Ampr)

ori
E. coli
eukariot

Produksi protein eukariot pada bakteri

Tidak stabil
Pelipatan protein salah
Tidak terjadi modifikasi pasca translasi

Tidak aktif
Pirogenik
Dikembangkan sistem ekspresi pada ragi, serangga, mamalia
untuk produksi:
Agen terapeutik yang tidak terkontaminasi
Protein aktif untuk studi biokimia, biofisika & struktur
Protein untuk proses industri

Modifikasi pasca translasi pada protein eukariot

Pemotongan oleh protease
Glikosilasi

Terjadi pada 30 % protein mamalia

Stabilitas protein
Sifat ikatan tertentu dari protein
Glikosilasi O : pada gugus OH dari Ser, Thr
Glikosilasi N : pada gugus amida dari Asn

Fosforilasi
Asetilasi
Penambahan S
Asilasi
-karboksilasi
Penambahan asam lemak C14 & C16

Sistem Prokariot Vs Eukariot

PROKARIOT
Jumlah protein
Medium sederhana
Pertumbuhan
Modifikasi pasca translasi tidak
ada
Ukuran protein
Konformasi protein sederhana
Kecenderungan pembentukan
badan inklusi
Tidak mampu menghilangkan
intron

EUKARIOT
Jumlah protein
Medium kompleks
Pertumbuhan
Modifikasi pasca translasi ada
Ukuran protein
Konformasi protein kompleks
Tidak ada kecenderungan
pembentukan badan inklusi
Mampu menghilangkan intron

Kuis 5
1. Ekspresi gen terdiri dari proses transkripsi yang menghasilkan mRNA dan
translasi yang menghasilkan protein
2. Vektor kloning bertujuan untuk mendapatkan DNA sehingga memiliki sifat
copy number tinggi Sedangkan vektor ekspresi bertujuan untuk
mendapatkan protein sehingga memiliki komponen tambahan untuk
membantu proses downstream/pemurnian
3. Contoh prokariot yang biasa digunakan untuk ekspresi adalah bakteri
Bacillus subtilis yang merupakan bakteri gram positif dan bakteri
Escherichia coli yang merupakan bakteri gram negatif sehingga dihasilkan
protein periplasmik.
4. Promoter pada Pichia pastoris adalah AOX1 yang diinduksi oleh metanol
5. Gambarkan skema vektor ekspresi eukariot dan sebutkan bagianbagiannya!