Produk ekspresi DNA rekombinan untuk penggunaan terapi manusia

G. M. Bhopale * dan R. K. Nanda

Teknologi DNA rekombinan (rDNA) telah membuat dampak revolusioner di bidang

manusia perawatan kesehatan dengan memungkinkan produksi massal produk ekspresi rDNA
yang aman, murni dan efektif. Saat ini, beberapa kategori produk rDNA, yaitu. hormon yang
menarik bagi terapi, hemopoietik faktor pertumbuhan, produk pembekuan darah, agen trombolitik,
antikoagulan, interferon, interleukin, dan enzim terapeutik diproduksi menggunakan teknologi
rDNA untuk penggunaan manusia. Itu artikel ini memberikan informasi tentang berbagai aspek,
yaitu. sistem ekspresi, produksi, pemurnian, analisis, dan aplikasi terapeutik produk rDNA.
Selanjutnya, masa depan produk rDNA dan skenario India juga disorot. Artikel ini harus
bermanfaat bagi para ilmuwan bioteknologi dan produsen biofarmasi.

Kata kunci: Biofarmasi, sistem host ekspresi, produksi, pemurnian dan analisis rDNA,
rekombinan protein terapi.

Munculnya teknologi DNA rekombinan (rDNA) dan teknologi aplikasi dalam industri
farmasi telah menghasilkan pertumbuhan pesat perusahaan bioteknologi dan sejumlah produk
rDNA terapeutik tersedia untuk digunakan manusia. Dipandangan semakin pentingnya produk
rDNA bagi manusia layanan kesehatan, artikel ini memberikan informasi umum / terkini pada
berbagai aspek, yaitu. sistem ekspresi, produksi, pemurnian, analisis dan aplikasi terapeutik yang
dipilih produk rDNA, terutama hormon yang menarik bagi terapi, faktor pertumbuhan
hemopoietik, pembekuan darah manusia produk, agen trombolitik, antikoagulan, interferon
manusia, interleukin manusia dan enzim terapeutik. Lebih lanjut, masa depan produk rDNA dan
skenario India juga disorot.

Sistem ekspresi

Prokariotik (bakteri) atau eukariotik (ragi, sel mamalia budaya) sistem umumnya
digunakan sebagai tuan rumah untuk produksi jumlah yang dapat digunakan dari produk rDNA
yang diinginkan2–4. Sebagian besar produk rDNA yang disetujui oleh FDA sedang diproduksi
menggunakan sistem ini. Bakteri seperti Escherichia coli banyak digunakan untuk ekspresi produk
rDNA. Mereka menawarkan beberapa keuntungan karena tingginya tingkat rekombinan ekspresi
protein, pertumbuhan sel yang cepat dan sederhana kebutuhan media. Namun, ada beberapa
batasan seperti akumulasi protein heterolog intraseluler, potensi degradasi produk karena jejak
engotor protease dan produksi endotoksin. Ragi seperti itu sebagai Saccharomyces cerevisiae,
Hansenulla polymorpha dan Pichia pastoris adalah salah satu organisme eukariotik yang paling
sederhana.

Mereka tumbuh relatif cepat dan sangat mudah beradaptasi produksi skala besar.
Organisme ini tidak menghasilkan endotoksin. Mereka mampu protein glikosilasi hingga tingkat
tertentu seperti sel mamalia. Sistem mamalia seperti sel ovarium hamster Cina (CHO) dan bayi
hamster sistem sel ginjal (BHK) sering menjadi pilihan untuk produksi protein terapi manusia.
Sistem sel CHO dan BHK adalah pilihan ideal karena ini mampu glikosilasi protein di situs yang
benar. Namun, biaya produksi produk yang menggunakan sistem ini tinggi

Kemajuan terbaru telah dibuat dalam memproduksi terapi protein dengan menggunakan
hewan transgenik5. Susu transgenic produksi saat ini paling layak6. Kelebihan ini sistem adalah
level ekspresi tinggi dan output volume, rendah investasi modal, biaya operasional rendah dan
dapat diproduksi ulang fasilitas produksi, yaitu kawin sedarah dapat melewati hewan kemampuan
untuk menghasilkan protein transgenik ke keturunannya. Meskipun daya tarik sistem ini, sejumlah
masalah tetap ada harus diselesaikan sebelum diterima secara luas oleh industry dan otoritas
pengatur sama. Ini termasuk, variabilitas tingkat ekspresi dan karakterisasi yang sifatnya tepat
modifikasi pasca-translasi di mamaria sistem.

Penggunaan tanaman rekayasa genetika untuk menghasilkan yang berharga protein

meningkat perlahan-lahan 7,8. Sistem memiliki potensi keuntungan ekonomi dan skalabilitas.
Namun variasi dalam hasil produk, kontaminasi dengan agrokimia dan pupuk, dampak hama dan
penyakit, dan penanaman variable kondisi juga harus dipertimbangkan. Kultur sel tanaman sistem
menggabungkan keuntungan dari sistem seluruh pabrik sebagai serta kultur sel hewan9-11.
Meskipun tidak ada rekombinan produk belum diproduksi secara komersial menggunakan pabrik
kultur sel, beberapa perusahaan sedang menyelidiki komersial kelayakan sistem produksi tersebut.

Produksi dan pemurnian produk rDNA

Proses umum untuk produksi produk rDNA adalah diilustrasikan pada Gambar 1. Langkah
pertama adalah isolasi

GAMBAR 1

gen yang diidentifikasi yang bertanggung jawab untuk ekspresi produk yang diinginkan.
Setelah isolasi dan karakterisasi gen manusia, itu dimasukkan ke dalam potongan-potongan kecil
melingkar DNA disebut plasmid. Plasmid rekombinan dimasukkan menjadi ragi bakteri atau sel
hewan berbudaya. Klon hasil transformasi sel inang diisolasi dan yang menghasilkan protein
bunga dalam jumlah yang diinginkan dipertahankan dalam kondisi yang sesuai sebagai bank sel
induk. Bank sel dikarakterisasi dan dipelihara dengan baik untuk digunakan selanjutnya prosedur
transformasi. Bank sel seharusnya secara berkala diuji viabilitas sel, genetik dan fenotipik
stabilitas. Ketika kebutuhan manufaktur muncul, sel-sel bekerja sel dapat ditingkatkan untuk
menghasilkan produk dalam botol roller dan / atau fermentor.

Fermentor umumnya digunakan untuk pertumbuhan E. coli atau ragi. Sel mamalia sering
ditanam dalam botol roller. Inokulasi sel inang yang mengandung vektor ekspresi adalah
ditambahkan ke volume media yang ditentukan di kedua fermentor atau botol roller. Sel-sel
dibiarkan tumbuh sampai nutrisi dalam medium habis atau diekskresikan oleh produk yang
mencapai tingkat penghambatan. Dengan memberikan yang seimbang campuran nutrisi dan / atau
bahan kimia untuk menetralkan akumulasi penghambat pertumbuhan, hasil produk dalam medium
atau sel Kepadatan bisa ditingkatkan. Di akhir proses, tuan rumah sel dipanen dan produk
rekombinan diisolasi dari media kultur atau sel.

Poin-poin berikut harus dipertimbangkan untuk produksi produk rDNA.

(1) Ketidakstabilan plasmid adalah masalah utama secara terus menerus dan fermentasi
skala besar, karena budaya ini mengalami banyak generasi. Efek yang dihasilkan adalah
produktivitas yang lebih rendah dan peningkatan biaya produksi, karena penumpukan sel bebas
plasmid yang tidak produktif. Terstruktur secara matematis dan memiliki model kinetik stabilitas
plasmid yang tidak terstruktur telah dikembangkan, yang pada akhirnya berguna untuk desain
proses rekombinan.

(2) Ekspresi tingkat tinggi produk rDNA berbeda sistem host sering dapat menghasilkan
agregasi dan akumulasi badan inklusi. Dalam kondisi yang sesuai, rDNA produk dapat disimpan
di lembaga inklusi di sekitar 50% atau lebih dari total protein sel. RDNA protein sangat murni,
stabil dan kompak. Pemulihan larut, protein rDNA aktif dari tubuh inklusi membutuhkan langkah-
langkah berikut harus dilakukan.

(a) Isolasi tubuh inklusi dari gangguan sel-sel dan sentrifugasi.

(B) Kelarutan protein tubuh inklusi menggunakan a chactrope (denaturant).

(c) Dalam kondisi reduksi (untuk memisahkan semua disulfide obligasi).

(d) Pemulihan protein aktif dengan menghilangkan denaturant dalam kondisi yang memungkinkan
protein untuk beradaptasi dengan aslinya konfigurasi.

(e) Ikatan disulfida yang tidak diinginkan, jika ada dalam struktur, perlu dioksidasi ulang dalam
kondisi terkendali, mencapai konfigurasi yang benar hadir di struktur asli.

(3) Bank sel harus diuji sel secara berkala viabilitas, stabilitas genetik dan fenotipe. Saat
eukariotik sel digunakan untuk produksi, membedakan genetik, fenotipik dan penanda imunologis
sel akan berguna dalam membangun identitas sel. Begitu juga kapan biakan mikroba digunakan,
fitur fenotipik spesifik yang membentuk dasar untuk identifikasi harus dijelaskan.

(4) Fermentor skala kecil tradisional digunakan untuk ekspansi sel dalam kultur suspensi.
Kehadiran, luasnya dan sifat kontaminasi mikroba dalam biakan kapal harus diperiksa secara
menyeluruh pada tahap yang sesuai selama produksi. Semua sistem terkait dengan fermentor harus
divalidasi sebelum digunakan secara rutin. Di India studi validasi harus dilakukan dengan tindak
lanjut studi validasi pada interval waktu yang sesuai.
 (5) Variabilitas yang tidak diinginkan dalam kultur selama produksi dapat menyebabkan
perubahan yang menyebabkan perubahan pada produk. Variasi tersebut dapat menghasilkan hasil
produk yang berbeda.

(6) Langkah-langkah dalam proses produksi harus divalidasi untuk memastikan bahwa
perantara proses berada di dalam spesifikasi. Pengujian apa pun yang digunakan selama validasi
proses itu sendiri harus divalidasi, sebelum proses validasi dimulai.

Pemurnian merupakan aspek penting dalam produksi produk rDNA. Tujuan keseluruhan
dari pemurnian adalah membawa sebanyak mungkin produk dengan sesedikit mungkin kerugian.
Seorang jenderal proses pemurnian disajikan pada Gambar 2. Dalam hal

GAMBAR 2

Produk yang diinginkan adalah intraseluler, fermentasi diikuti dengan memanen sel. Langkah ini
biasanya dicapai oleh sentrifugasi atau filtrasi. Sel-sel terganggu atau lisis dan puing sel
dihilangkan dengan sentrifugasi, meninggalkan a larutan encer dari produk yang diinginkan
mentah. Jika mamalia atau sistem ragi digunakan, produk yang diinginkan dapat diperoleh
langsung dari medium. Saat ini, ultrafiltrasi telah menjadi metode pemilihan konsentrasi produk.

Ada beberapa metode berbeda yang dapat digunakan pemurnian produk rDNA, tetapi
hanya kromatografi metode pemurnian umumnya digunakan (Tabel 1) 13-15. SEBUAH
kombinasi dua hingga empat teknik kromatografi yang berbeda umumnya digunakan di hilir khas
prosedur pemrosesan. Filtrasi gel dan kromatografi pertukaran ion adalah yang paling umum.
Kromatografi afinitas digunakan sedapat mungkin, karena memiliki biospecificity tinggi dan
seseorang dapat mencapai tingkat pemurnian yang tinggi.

Perhatian yang tepat perlu diberikan untuk validasi proses pemurnian seperti kapasitas
pemuatan kolom dan regenerasi kolom. Proses pemurnian harus divalidasi untuk memastikan
bahwa itu cukup untuk menghilangkan asing zat seperti bahan kimia yang digunakan dalam
pemurnian, kontaminasi kolom, endotoksin, protein seluler residu dan virus. Reproduksibilitas
proses pemurnian sehubungan dengan kemampuannya untuk menghilangkan kontaminan tertentu
juga harus ditentukan. Selanjutnya, kolom juga harus divalidasi terkait pencucian legenda (mis.
pewarna, afinitas legenda, dll.) sepanjang umur kolom yang diharapkan. Bukti kemurnian produk
yang dimurnikan harus mapan. Fisika-kimia, biologi dan imunologi karakterisasi produk yang
dimurnikan juga harus diperoleh menggunakan berbagai tes analitik. Karakterisasi tes produk
dapat meliputi komposisi asam amino, pemetaan peptida, uji elektroforesis (SDS-PAGE, Western
blot, fokus isoelektrik), HPLC, immunoassay, uji endotoksin, uji penentuan potensi, dll.

Analisis produk rDNA

Metode analitik memainkan peran penting dalam penentuan identitas, kemurnian dan potensi
produk rDNA dengan hormat

TABEL 1

GAMBAR 3

Untuk obat yang aman dan manjur untuk penggunaan manusia. Ringkasan dari metode analitik
yang digunakan dalam analisis produk adalah diilustrasikan pada Gambar 3 dan dijelaskan secara
singkat dalam berikut ini bagian. Prosedur utama dan terperinci tersedia untuk para pembaca yang
tertarik.

Asam bikinchoninat dan metode Bradford umumnya digunakan untuk penentuan

konsentrasi protein dalam rDNA produk. Metode ini penting karena memberikan protein
konsentrasi produk yang digunakan dalam pengujian lain. Pengurutan protein menyediakan
informasi struktur. Amino analisis asam digunakan untuk mengidentifikasi produk rDNA
berdasarkan komposisi asam amino mereka. Pemetaan peptida digunakan untuk membandingkan
struktur protein produk dengan struktur protein standar referensi dan untuk mengkonfirmasi
konsistensi lot-ke-banyak struktur primer. Tes elektroforetik (natrium dodecylsulphate
elektroforesis gel poliakrilamid, Western blot dan fokus isoelektrik) paling kuat untuk
mengevaluasi rDNA kemurnian produk, identitas, homogenitas, dan stabilitas. Lebih Baru-baru
ini, elektroforesis kapiler telah menghasilkan banyak bunga sebagai teknik pelengkap dalam
analisis produk rDNA. Tes ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi perubahan molekul atau
kimia dalam molekul karena denaturasi, agregasi, oksidasi, deamidasi, dll.

Metode kromatografi, yaitu. fase balik-HPLC, ukuran kromatografi eksklusi dan interaksi
hidrofobik kromatografi digunakan dalam penentuan kemurnian produk serta tingkat pengotor
atau degradasi yang diketahui produk. Immunoassay dan hibridisasi DNA adalah digunakan untuk
penentuan kotoran sel inang. Polymerase reaksi berantai, yang melibatkan amplifikasi DNA,
mungkin terbukti berguna dalam deteksi dan identifikasi DNA kontaminan. Tes limulus
amebocyte lysate (LAL) adalah yang paling sensitive dan tes khusus untuk mendeteksi dan
mengukur endotoksin. Komparatif Studi menunjukkan bahwa tes LAL lebih sensitive dari uji
pirogen kelinci.

Potensi produk rDNA umumnya dinilai oleh teknik khusus. Pilihan uji sering ditentukan

oleh sifat produk dan terapi yang dimaksud aplikasi. Uji model hewan, uji berbasis kultur sel dan
uji in vitro (physico-chemical) digunakan untuk penentuan potensi produk rDNA. Tes ini
membutuhkan standar referensi (dikalibrasi dalam unit internasional) dan dukungan statistik untuk
menginterpretasikan data yang dihasilkan dengan benar.

Selain tes analisis protein yang disebutkan sebelumnya, analisis karbohidrat untuk
glikoprotein memainkan peran utama dalam mengkarakterisasi produk rDNA. Di banyak produk,
perubahan dalam struktur karbohidrat telah mempengaruhi aktivitas biologis. Beberapa poin harus
dipertimbangkan untuk analisis rDNA produk. Tes identitas biasanya memerlukan kombinasi
metode. Tes-tes ini harus sangat spesifik untuk unik sifat-sifat produk. Kombinasi metode harus
digunakan untuk menilai kemurnian produk; metode harus menjadi kuantitatif dan mampu
membedakan yang diinginkan protein dari kotoran yang berhubungan dengan produk. Terkait
proses pengotor harus diminimalkan. Batasan terkait produk pengotor harus ditetapkan dan metode
kuantitatif digunakan untuk memastikan bahwa batas-batas ini dipenuhi. Tes potensi harus
memiliki batas kepercayaan yang luas dan dapat mencakup hewan bioassay, uji kultur sel in vitro
atau uji biokimia. FDA saat ini mengatur produk rDNA tertentu sebagai narkoba. Semua obat
rDNA menjalani kontrol kualitas yang ketat pengujian untuk memenuhi spesifikasi yang telah
ditentukan. Perbedaan mendasar antara kontrol kualitas sistem untuk obat rDNA dan kebohongan
obat tradisional dalam jenis metode yang digunakan untuk menentukan identitas obat, kemurnian
dan potensi. Penggunaan standar referensi yang sesuai dari sumber yang diakui secara
internasional seperti WHO, NIH, dll.

Penting untuk identifikasi dan kemurnian turunan rDNA narkoba. Pengujian potensi sangat
penting, memastikan bahwa obat tersebut akan berkhasiat ketika diberikan ke pasien.

Aplikasi terapi produk rDNA

Penggunaan protein terapeutik untuk menggantikan atau menambah molekul protein

endogen telah lama terbentuk pengobatan untuk penyakit. Aplikasi beberapa hal penting Produk
rDNA (Tabel 2) disetujui oleh FDA untuk manusia penggunaan terapi dijelaskan secara singkat di
bagian berikut.