6

PROTEIN REKOMBINAN

6.1 PENDAHULUAN

Protein adalah bahan yang paling penting dari semua bahan yang membentuk
organisme

hidup. Protein terkandung dalam setiap sel hidup pada semua organisme, tanpa
pengecualian,

dan di dalam sel, protein berada dalam jumlah yang sangat banyak dengan berbagai
bentuk

atau jenis. Semua karakteristik dari organisme ditentukan oleh aktivitas

protein.

6.2 LATAR BELAKANG

Dalam biologi molekuler, yang disebut “Central Dogma”, menyatakan bahwa informasi
gen

yang tersimpan di dalam DNA dipindahkan ke RNA dan kemudian dipindahkan ke

protein.

Proses transfer dari DNA ke RNA disebut proses transkripsi, sedangkan proses transfer
dari

RNA ke protein disebut proses translasi. Kode-kode gen dalam protein disebut gen
struktural

karena mereka bertanggung jawab untuk mengekspresikan informasi gen ke dalam unit

struktural pada manusia, seperti warna mata, kulit dan

rambut.

6.3 DEFINISI

Rekombinan protein adalah suatu bentuk manipulasi dari protein, yang dihasilkan
dalam

berbagai cara untuk menghasilkan sejumlah besar protein, memodifikasi urutan gen
dan

memproduksi produk komersial yang bermanfaat. Pembentukan protein rekombinan

dilakukan melalui perantara khusus yang dikenal sebagai vector. Teknologi rekombinan

adalah proses yang terlibat dalam pembentukan protein

rekombinan.

69
6.3.1 Rekombinasi

Rekombinasi adalah suatu proses dimana suatu progeny (keturunan) dikembangkan

menjadi

kombinasi gen-gen yang berbeda dari gen-gen kedua orang tua nya, yang
menghasilkan satu

set DNA baru.

Gambar 6.1. Penyilangan molekul DNA untuk menghasilkan protein

 rekombinan

Ditunjukkan pada gambar 6.1 adalah proses dari rekombinasi protein, diadaptasi
dari

artikel dari Pusat Informasi Nasional Bioteknologi

(NCBI).

Istilah “protein” digunakan karena protein adalah struktur yang mendukung DNA
dan

merupakan blok bangunan materi hidup. Digunakan istilah “DNA rekombinan” untuk

menggambarkan urutan DNA baru yang telah dihasilkan dari rekombinasi gen dari
kedua

orang tuanya. Proses rekombinan tersebut menjadi landasan terhadap kejadian evolusi
dari

makhluk hidup.

6.4 PROTEIN REKOMBINAN

Teknologi DNA rekombinan adalah salah satu cara mempelajari fungsi dan interaksi
dari

protein. Hal ini dilakukan dengan mengisolasi urutan DNA target dan kemudian

memindahkannya ke vektor kloning yang memiliki kemampuan untuk mereproduksi diri.

Urutan DNA dari vektor kloning berinteraksi dengan DNA target dan menghasilkan
cetak

biru informasi gen baru yang disebut DNA rekombinan. DNA rekombinan tersebut

ditransfer ke RNA, yang pada proses berikutnya menghasilkan protein

rekombinan.

6.4.1 Produksi protein rekombinan

Rekombinan DNA merupakan bidang ilmu pengetahuan yang hangat diperbincangkan

yang
berhubungan dengan pembuatan organisme – mulai dari bakteri hingga kambing --

memproduksi protein yang biasanya tidak dihasilkan oleh suatu organisme. Penelitian
di

bidang ini telah menghasilkan berbagai macam aplikasi dimana pada beberapa tahun
yang

lalu masih belum memungkinkan. Penderita diabetes yang biasanya bergantung pada
insulin

70
dari babi, dimana mirip dengan manusia tetapi tidak persis sama, sekarang dapat
memiliki

insulin dari manusia yang pada saat ini telah dapat diproduksi oleh bakteri. Penderita

hemophilia dapat menggunakan faktor pembekuan yang telah diproduksi dalam susu

kambing. Sementara ilmu pengetahuan yang kompleks, dapat diuraikan ke dalam

konsep

yang lebih sederhana.

Gambar 6.2. Skema rekombinasi

protein
 Dalam rangka untuk memahami bagaimana protein rekombinan dibuat,
sebelumnya

kita perlu memahami bagaimana semua protein dibentuk. DNA berada didalam inti sel,
DNA

memegang semua petunjuk yang diperlukan untuk membentuk suatu organisme.

Seiring

dengan itu rangkaian helai panjang dari DNA adalah suatu instruksi untuk terbentuknya

berbagai protein.

6.4.2 Struktur DNA

DNA adalah dasar genetik untuk semua makhluk hidup dan seluruh kehidupan pada
dasarnya

mempunyai struktur DNA yang sama. Untai panjang dari DNA pada dasarnya terdiri
dari

jutaan unit berulang yang disebut nukleotida. Setiap nukleotida memiliki tiga bagian:
gula,

gugus fosfat dan basa nitrogen. Struktur akhir DNA adalah dua helai yang terhubung di

bagian tengah, mirip sebuah tangga atau tangga spiral. Masing-masing sisi terdiri dari
fosfat

dan gula yang berulang-ulang terus dan penghubung diantaranya terdiri dari dua basa

nitrogen yang bergabung bersama-sama. Hanya ada empat basa nitrogen dan mereka

direpresentasikan dengan kode-kode TCAG. Sebuah DNA dari organisme merupakan

jutaan

71
basa-basa panjang tetapi urutan dari Ts, Cs, As dan Gs yang membuat kita mempunyai

perbedaan satu dengan yang

lainnya.
6.4.3 Struktur dan Fungsi protein

DNA yang kita miliki menentukan dengan tepat bagaimana kita akan terlihat dan
bagaimana

setiap sifat yang kita miliki, tetapi semua DNA hanya merupakan kode-kode sederhana
untuk

protein-protein yang berbeda. Sebenarnya protein tersebut yang membuat kita menjadi

bentuk seperti sekarang ini. Protein merupakan rangkaian rantai panjang dari asam
amino

sama seperti DNA yang juga merupakan rantai panjang dari nukleotida. Terdapat 20
asam

amino pada keberadaan protein dan setiap organisme menggunakan 20 asam amino
tersebut

dalam kombinasi yang berbeda-beda untuk membentuk setiap

protein .

Urutan asam amino ini sangat penting karena urutan tersebut memberikan
bentuk

akhir dari protein. Bentuk dari protein sangat penting, hal tersebut memberikan
karakteristik

dari protein. Inilah sebabnya mengapa protein rekombinan sangat penting.

Menggunakan

insulin babi, yang memiliki struktur sedikit berbeda dengan insulin manusia, selalu
berisiko

karena beberapa orang akan menolaknya. Namun, insulin rekombinan mempunyai

urutan

asam amino yang persis sama seperti insulin manusia, kecuali yang dihasilkan oleh
bakteri.

Hanya karena bakteri memiliki kode genetik didalamnya tidak berarti bahwa
bakteri

akan segera memulai membuat suatu protein rekombinan. Para ilmuwan harus
merekayasa

bagian promotor untuk melampirkan kode yang diinginkan sebelumnya dan kemudian

mereka dapat mengaktifkannya. Setelah semua ini ditambahkan ke dalam bakteri atau

organisme lain, sel-sel mulai membuat protein baru, karena urutan dari asam amino
yang

sama maka produk protein akan 100% identik dengan sumbernya dank arena itu lebih
aman

untuk digunakan.

6.4.4 Pilihan host untuk amplifikasi

protein

Sistem host tersedia dalam beberapa bentuk termasuk fag, bakteri, ragi, tumbuhan,
jamur

berserabut, serangga atau sel mamalia yang tumbuh dalam kultur dan hewan
transgenik.

Pilihan terakhir dari host akan bergantung pada persyaratan yang spesifik dan aplikasi
untuk

protein rekombinan. Pemilihan host tidak hanya mempengaruhi amplifikasi dan isolasi
dari

protein, tetapi juga cara dimana produk kemudian dapat dimurnikan. Dalam rangka
untuk

memutuskan host mana yang paling cocok dalam jumlah dan tingkat kemurnian produk
serta

integritas biologis dan potensi toksisitas sebaiknya dipertimbangkan. Sebagai contoh,

sistem

72
ekspresi bakteri tidak cocok jika modifikasi pasca-translasi diperlukan untuk
menghasilkan

produk rekombinan yang dapat berfungsi

 penuh.

Lokasi produk dalam host akan mempengaruhi pilihan metode untuk isolasi dan

pemurnian dari produk. Sebagai contoh, sebuah host bakteri dapat mensekresikan
protein ke

dalam media pertumbuhan, mentransportnya ke dalam ruang periplasmik atau

menyimpannya

sebagai badan inklusi yang tidak dapat larut dalam

sitoplasma.

Tabel 6.1. Keuntungan dan kerugian dalam pemilihan

host

Host Advantages Disadvantages

High endotoxin content in gram negative
Bacteria
bacteria
e.g.Escherichia coli
much experience
Product can be designed for secretion into the
No post-translational modification growth media
No post-translational modification
Bacteria e.g.
Staphylococcus aureus
rowth media Does not express such high levels as E.
Wide choice of cloning vectors Gen
immunogenicity may differ

Easy to grow with high yields (prod

form up to 50% of total cell protein) Pa

Mammalian cells Same biological activity as native proteins Cells can be difficult and expensive to grow

Mammalian expression vectors available Cells grow slowly

Can be grown in large scale cultures Manipulated cells can be genetically unstable

Low productivity as compared to micro-organisms

Yeasts Lacks detectable endotoxins Gene expression less easily controlled

Generally Regarded As Safe (GRAS) Glycosylation not identical to mammalian systems

Fermentation relatively inexpensive Facilitates

glycosylation and formation of disulphide
bonds

Only 0.5% native proteins are secreted so

isolation of secreted product is simplified Well
established large scale production and
 downstream processing
a clinical trial
Cultured insect cells
Few differences in functional and antigenic properties
Baculovirus vector
between product and native protein
chanisms similar to
Virus stops host protein amplification. High
Lack of information on glycosylation mechanisms level expression of product
Lack of information on glycosylation mechanisms

Safe, since few arthropods are ade

hosts for baculovirus
Product not always fully functional

Baculovirus vector received FDA a

Tabel 6.1. (Lanjutan) Keuntungan dan kerugian pemilihan host
Well established systems for
Host Advantages Disadvantages Fungi
High level of expression not yet achieved
fermentation e.g.Aspergillus sp. of filamentous fungi
Growth inexpensive Genetics not well characterized A.niger is GRAS No cloning vectors available Can
secrete large quantities of product into growth media, source of many industrial enzymes Plants Low
transformation efficiency
Long generation time
6.4.5 Pilihan Vektor
Dalam rangka untuk mengkloning gen yang diinginkan semua vector yang telah
direkayasa
memiliki pilihan situs hilir restriksi unik dari urutan promotor transkripsi. Pilihan keluarga
vector diatur oleh host/inang nya. Setelah host telah dipilih, berbagai macam vector
yang
berbeda dapat dipertimbangkan, dari ekspresi vector yang sederhana hingga vector
yang
mengeluarkan/mensekresikan protein fusi.
Namun, seperti untuk pemilihan dari system host yang sesuai, pilihan terakhir dari
vector harus mempertimbangkan persyaratan khusus dari aplikasi dan tentu saja akan
dipengaruhi oleh perilaku dari protein target. Salah satu faktor kunci yang telah
menyebabkan
meningkatnya penggunaan vector protein fusi adalah amplifikasi dari protein fusi yang
berisi
tag dengan ukuran yang telah diketahui dan fungsi biologis sangat mudah untuk
menyederhanakan isolasi, pemurnian dan selanjutnya deteksi. Dalam beberapa kasus
hasil
protein juga dapat ditingkatkan.
Pemeliharaan dan protokol kloning sangat spesifik untuk setiap vector dan petunjuk
yang diberikan oleh pemasok harus diikuti dengan hati-hati.
Table 6.2. Memberikan tinjauan beberapa fitur amplifikasi fusi protein yang dapat
mempengaruhi pilihan terakhir dari vektor.
Advantages Disadvantages Fusion proteins Cell compartments can be targeted Tag may interfere with
protein structure and
affect folding and biological activity Provide a marker for expression Cleavage site is not always 100%
specific if tag
needs to be removed Simple purification using affinity chromatography under denaturing or
non-denaturing conditions Easy detection
74
Refolding achievable on a chromatography column Ideal for secreted proteins as the product is easily
isolated from the growth media Non- fusion proteins No cleavage steps necessary Purification and
detection not as simple
Problems with solubility may be difficult to overcome, reducing potential yield
6.4.6 Vektor untuk protein non-fusion
Tabel 6.3. Menunjukkan contoh vektor non-fusion
Comments Prokaryotic vector for expression of proteins encoded by inserts
Vector family pTrc 99 A
lacking a start codon, inducible

by IPTG
pKK223-3 For over-expression of proteins under the control of the strong tac promotor in prokaryotes
pSVK 3 For in vivo expression in mammalian cell lines
PSVL SV40 For high level transient expression in eukaryotic cells
pMSG For inducible expression in mammalian cells
6.4.7 Vektor untuk protein fusi
Tabel 6.4. Menunjukkan contoh dari vector untuk protein fusi bersama dengan produk
pemurnian yang diperlukan.
Vector family Tag Purification Products pGEX Glutathione S-transferase GST MicroSpinTM Purification
Module
GSTrapTM Glutathione SepharoseTM Fast Flow PQE 6 x Histidine His MicroSpin Purification Module
HisTrapTM HiTrapTM Chelating Chelating Sepharose Fast Flow pET 6 x Histidine His MicroSpin
Purification Module
IgG binding
HisTrap HiTrap Chelating Chelating Sepharose Fast Flow pEZZ 18 (non-inducible expression)
domain of protein A IgG Sepharose 6 Fast Flow
pRIT2T(expression inducible IgG binding domain of
protein A IgG Sepharose 6 Fast Flow by temperature change)
75
6.4.8 Pilihan tag fusi
Dua tag yang paling sering digunakan adalah glutathione S-transferase (GST tag) dan 6
x

residu histidine (His)6 tag. Adapun pemilihan dari host dan vector, keputusan untuk

menggunakan baik GST atau (His)6 tag harus dibuat sesuai dengan kebutuhan aplikasi
spesifik
Tabel 6.5. Menyoroti beberapa fitur kunci dari tag yang harus dipertimbangkan.
GST tag (His)6 tag Can be used in any expression system Can be used in any expression system
Purification
Purification procedure gives high yields of pure product product
procedure gives high yields of pure

Selection
Selection of purification products available for any scale scale
of purification products available for any

pGEX6P PreScissionTM protease vectors enable cleavage and

Small tag may not need to be removed e.g. tag is poorly purification in a single step immunogenic so
fusion partner can be used directly as
Site-specific
an antigen in antibody production Site-specific proteases enable cleavage of tag if required
required.
proteases enable cleavage of tag if

N.B. Enterokinase sites that enable tag cleavage without leaving behind extra amino acids are preferable
GST tag easily detected using an enzyme assay or (His)6 tag easily detected using an immunoassay an
immunoassay Simple purification. Very mild elution conditions Simple purification, but elution conditions
are not as minimize risk of damage to functionality and mild as for GST fusion proteins. Purification can be
antigenicity of target protein performed under denaturing conditions if required.
N.B. Neutral pH but imidazole may cause precipitation Desalting to remove imidazole may be necessary
GST tag can help stabilize folding of recombinant proteins (His)6 - dihydrofolate reductase tag stabilizes
small
peptides during expression Fusion proteins form dimers Small tag is less likely to interfere with structure
and
function of fusion partner Mass determination by mass spectrometry not always accurate for some (His)6
fusion proteins*
76
6.4.9 Penanganan badan
inklusi

Amplifikasi sering dapat dikendalikan sehingga protein rekombinan terakumulasi dalam

ruang intraseluler atau disekresikan ke dalam ruang periplasmik. Sedangkan sekresi

menguntungkan dari segi protein folding, kelarutan dan oksidasi sistein, hasilnya
umumnya

jauh lebih tinggi bila menggunakan ekspresi

intraseluler.

Namun demikian, protein rekombinan yang terakumulasi intrasel sering diatur

dalam

bentuk badan inklusi, agregat terlarut dari protein yang berkurang aktivitas biologisnya.
Jadi,

sementara kehadiran badan inklusi dapat membuat langkah awal dari isolasi menjadi
sangat

sederhana, isolasi protein dari badan inklusi sering menyebabkan kesulitan dengan
lipat-

ulang dari protein, mengembalikan reformasi yang benar dari ikatan disulfide dan
dengan

demikian terjadi pemulihan penuh aktivitas

biologis.

Tabel 6.6. Merangkum keuntungan dan kerugian dari bekerja dengan produk
rekombinan

yang dinyatakan sebagai badan

inklusi.

Advantages Disadvantages

High expression levels can reduce fermentation costs Re-folding shifts difficulties and costs
downstream

Easily monitored by SDS-PAGE or immunoblotting Amplification cannot be monitored directly

by functional assays

Cytoplasmic proteins are easily washed away Minor contaminants are often hydrophobic, poorly

soluble membrane proteins and cell wall

fragments

Major contaminants are oligomers and misfolded Can be difficult to separate multiple forms of the

or proteolyzed forms of the protein same protein

pL promoter with T induction often yields protein If the protein does not fold well, another expression

where other systems fail system will be needed

6.5 APLIKASI
Proses rekombinan protein digunakan untuk berbagai tujuan penelitian secara
komersial,

medis dan ilmiah. Dapat juga digunakan pada peternakan secara komersial untuk
melawan

penyakit pada ternak serta

tanaman.

Rekombinan protein mempunyai peran besar dalam penciptaan bahan terapeutik

yang

dapat memodifikasi dan memperbaiki kesalahan genetik, menghancurkan sel-sel

kanker,

mengobati gangguan system kekebalan tubuh, dan masih banyak fungsi-fungsi lainnya.

77
Sebagai contoh, Erythropoietin, sebuah protein hormone yang diproduksi dengan
teknologi

rekombinan dapat digunakan dalam merawat pasien dengan kekurangan/defisiensi

eritrosit,

yang merupakan penyebab umum dari komplikasi

ginjal.

Ada bidang medis yang disebut farmakologi rekombinan, dimana rekombinan

protein

digunakan untuk memproduksi pengobatan DNA yang diturunkan seperti interleukins;

yang

mengatur sel T, hormon pertumbuhan; digunakan untuk merangsang pertumbuhan,

eritropoietin; yang merangsang produksi sel darah merah dalam sumsum tulang, dan
insulin;

digunakan untuk mengobati diabetes tipe 1. Protein rekombinan juga dapat digunakan
di

laboratorium sains untuk penelitian stem cell dan penelitian

kloning.
 Di masa depan bioteknologi dapat menimbulkan peningkatan perkembangan dari

organ manusia di laboratorium dan produksi dari tanaman yang dapat menghasilkan
pestisida

sendiri. Meskipun masih banyak perdebatan etis dan pertanyaan, teknologi rekombinan

memiliki potensi untuk merevolusi produksi pangan, perawatan kesehatan dan proses

penuaan. Protein Rekombinan di mulai dari pertama kali saat Insulin diproduksi oleh E.

coli

oleh Herbert Boyer di San Fransisco Amerika dibawah perusahaan Genentech Inc
1978.

Peristiwa ini begitu mengagetkan dunia karena dengan keberhasilan produksi protein

rekombinan tersebut merubah sebagian besar peta industri di

dunia.

Bayangkan sebelum dapat diproduksi oleh E. coli insulin didapatkan dengan cara

membantai sekian ribu sapi dan babi, proses penjagalannya pun harus khusus demi
menjamin

kualitas insulin yang akan disolasi dari hewan ternak tersebut. Dengan keberhasilannya

diproduksi pada E. coli maka ini akan mengurangi biaya produksi Insulin menjadi jauh

dibawah prediksi sebelumnya.

Escherichia coli adalah mikroorganisme yang paling terkait dengan berbagai

bidang

bioteknologi karena bakteri inilah organisme pertama yang dipelajari secara lengkap
baik dari

sisi metabolismenya, fisiologinya, regulasi genetikanya bahkan sampai sequence

genomnya.

Bukan hanya karena kemudahannya untuk di manipulasi akibat lengkapnya informasi

tentang

E.Coli melainkan juga karena kemudahannya untuk di kulturkan dan cepatnya proses
pertumbuhannya berlangsung dibandingkan dengan berbagai macam organisme yang
lain.

Oleh karena itu E. Coli mendapatkan kehormatan menjadi organisme model yang
cukup

penting dalam dunia protein

rekombinan.

Proses regulasi gen yang telah lengkap dipelajari dan telah banyak dimanipulasi
telah

menyebabkan E. coli menjadi organisme model yang paling banyak mempunyai variasi

pilihan untuk dijadikan host dalam proses produksi protein

rekombinan

78
6.6 INSULIN REKOMBINAN

Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik

denganinsulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah

dilemahkan.

Gambar 6.3. Bakteri Escherichia coli yang digunakan sebagai hospes pembuatan
protein

rekombinan
6.6.1 Bakteri Gram negatif, E. coli, penghuni alami saluran pencernaan
manusia

Sejak Banting dan Best menemukan hormon insulin pada tahun 1921, pasien diabetes

mellitus yang mengalami peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi

insulin, telah diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas

hewan. Meskipun insulin sapi dan babi mirip dengan insulin manusia, namun

komposisinya

sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan

antibodi

terhadap insulin babi dan sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon

inflamasi pada tempat injeksi. Selain itu efek samping dari insulin sapi dan babi ini
adalah

kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi zat asing yang
rutin.

Faktor-faktor ini menyebabkan peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin

dengan

memasukkan gen insulin ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk

memproduksi insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami diproduksi. Hal
ini

telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA

rekombinan.

79
6.6.2 Struktur insulin

Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino,
30 di

antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai
kedua.

Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan

disulfida.

Gambar 6.4. Struktur protein insulin

manusia

Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek
dari

kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam
rantai

B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari

rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen. Ada

empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin. Sintesis
protein

tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut yang

diulang.
6.6.3 Proses produksi

Escherrichia coli (E. coli), penghuni saluran pencernaan manusia, adalah „pabrik‟ yang

digunakan dalam rekayasa genetika insulin. Ketika bakteri berreproduksi, gen insulin

direplikasi bersama dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan
cepat

mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara

menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini. Pada E. coli, B-

galaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen. Untuk membuat bakteri

memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada enzim

ini.

80

Gambar 6.5. Skema pembuatan insulin

rekombinan
 Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak
seperti

pisau bedah biologi, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah
satunya

rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan

pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik
dari

kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. Sedangkan DNA

ligase

adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung
nukleotida.

Gambar 6.6. Skema kerja enzim restriksi

endonuklease

81
Langkah pertama pembuatan humulin adalah mensintesis rantai DNA yang
membawa

sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari
insulin.

Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari
kedua

rantai telah dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis
rantai

A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai yang

menandakan pengakhiran sintesis

protein.

Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di

setiap

awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel
bakteri itu.

„Gen‟ sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk

enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid vektor tersebut. Pada
tahap ini,

sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-

galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel

E. coli.
 6.7. Mikroskopis plasmid E. coli dengan mikroskop
elektron

Praktis penggunaan teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia

membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen
insulin

dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan
sel

mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani

mitosis.

82
 6.8. Skema pembentukan insulin rekombinan pada kultur E.
coli

Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke

salah satu

rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen
B-

galaktosidase dan dimurnikan.

Gambar 6.9. Struktur beta galaktosidase rantai A dan rantai B yang telah
dimurnikan

Kedua rantai dicampur dan

dihubungkan kembali dalam reaksi yang

 membentuk jembatan silang disulfida,

menghasilkan Humulin murni (insulin

manusia sintetis).

Gambar 6.10. ikatan disulfida yang terbentuk pada dua rantai protein insulin A dan B

83
6.6.4 Implikasi biologis dari rekayasa genetika Humulin
rekombinan

Humulin merupakan protein hewani yang dibuat dari bakteri sedemikian rupa sehingga

strukturnya benar-benar identik dengan molekul alami. Hal ini akan mengurangi

kemungkinan komplikasi yang disebabkan produksi antibodi oleh tubuh manusia.

Dalam

studi kimia dan farmakologi, insulin rekombinan DNA manusia yang diproduksi secara

komersil telah terbukti bisa dibedakan dari insulin pankreas

manusia.

Awalnya, kesulitan utama yang dihadapi adalah kontaminasi produk akhir oleh
sel

inang, sehingga meningkatkan resiko kontaminasi dalam kaldu fermentasi. Bahaya ini
diatasi

dengan ditemukannya proses pemurnian. Ketika dilakukan tes pada produk akhir
insulin,

termasuk teknik terbaik radio-immuno assay, tidak ada „kotoran‟ yang

terdeteksi.

Seluruh prosedur, sekarang dilakukan dengan menggunakan sel ragi sebagai media

pertumbuhan, karena sel ragi dapat menghasilkan sebuah molekul insulin manusia
yang
hampir lengkap dengan struktur tiga dimensi yang sempurna. Ini meminimalkan
kebutuhan

untuk prosedur pemurnian kompleks dan

mahal.

6.7. Hormon Pertumbuhan rekombinan untuk memacu pertumbuhan ikan gurame

(Osphronemus
gouramy)

Ikan gurame (Osphronemus gouramy) merupakan salah spesies target revitalisasi

perikanan

untuk tujuan konsumsi dalam negeri, yang diharapkan produksinya terus meningkat
setiap

tahun. Target produksi ikan gurame nasional tahun 2007 belum tercapai (Nurdjana,
2008).

Rendahnya kualitas benih dan pakan yang digunakan petani ikan diduga merupakan
faktor

utama penyebab target produksi nasional tersebut tidak

terealisasi.

Kualitas benih ikan dapat ditingkatkan melalui aplikasi metode selektif breeding,

hibridisasi, poliploidisasi (triploidisasi), dan transgenesis. Namun demikian, teknik

pemijahan

ikan gurame secara terkontrol/buatan sebagai prasyarat bagi teknologi-teknologi

tersebut

belum tersedia. Pendekatan lain yang bisa digunakan untuk memacu pertumbuhan ikan

gurame adalah pemberian pakan berkualitas tinggi; kadar protein tinggi. Pakan buatan
untuk

memacu pertumbuhan ikan gurame mulai dari benih hingga untuk pembesaran
disarankan

menggunakan kadar protein tinggi, 33,9-43,3% (Mokoginta et al.,

1994).
 Persentase kadar protein yang cukup tinggi tersebut, diduga menjadi salah satu

penyebab petani kurang tertarik untuk menggunakannya, karena pakan yang memiliki
protein

tinggi adalah lebih mahal dibandingkan dengan pakan dengan kandungan protein
rendah.

Umumnya petani memberi makan ikan gurame berupa pakan buatan yang
mengandung

protein <30% atau dengan daun talas saja. Pakan dengan kadar protein rendah, sekitar
28%,

84
yang ditambahkan bahan stimulan pemacu pertumbuhan ikan, atau pemberian pakan
alami

diperkaya dengan bahan stimulan tersebut diduga menjadi alternatif untuk mengatasi
masalah

rendahnya kecepatan tumbuh ikan

gurame.

6.8. REFERENSI
1. Anonim, The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification,
Edition AA, Amersham Pharmacia Biotech, page 6-8; 57 2.
http://www.dnassequencing.com/category/recombinant-protein-images/ 3. Kayser, O., dan
Muller, R.H. (2004). Pharmaceutical Biotechnology; Drug Discovery and
Clinical Applications. Willey-VCH: German. 4. Production of Recombinant Protein,
http://www.ehow.com/about_5366348_production-
recombinant-protein.html 5. Recombinant Protein Definition,
http://www.ehow.com/about_5407160_recombinant-protein-
definition.html 6. Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius: Yogyakarta. 151-178.
7. What Are Recombinant Proteins?, http://www.ehow.com/info_8131260_recombinant-
proteins.html
85