Protein

• Asal kata protos, Yunani, “paling utama"

• Senyawa organik kompleks, BM tinggi, 15000 -20.000.000
• Merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino, dihubungkan
satu sama lain dengan ikatan peptida
• Protein pertama kali ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius thn 1838
Proteins

• T’dr ≥1 polipeptida
• Dlm fungsi biologiknya:
• Struktur molekul melipat khas menjadi btk globular atau fibrous
• Untai AA pd protein ditentukan olh untai gen yg menyandi dlm sandi
genetik
• Umumnya, sandi genetik dicirikan 20 AA (esensial) standard
Proteins

• Modifikasi protein pasca translasi

merubah:
• Sifat fisik dan kimia , folding, stability,
activitas, dan fungsi
• Pd protein dpt ditemukan grup non-
peptide, disebut “grup prosthetic” or
“Cofactors”
• Protein juga dpt bekerja dgn protein lain
Peran protein:

• Menentukan kebanyakan sifat-sifat dlm kehidupan

• Sbg protein fungsional (enzim/hormone, dll)
• Pembentuk jaringan (kolagen, keratin atau otot) = protein struktural
• Protein pembawa ( ferritin, apoprotein)
• Imun humoral (Antibodi)
• Sifat hereditas (protein histon) dlm sintesis protein
• Pembentukan sel darah
• Sumber energi.
Peran Protein
• Penting dalam:
• Struktur dan fungsi semua Sel
makhluk hidup dan virus
• Sbg komponen penyimpanan (dalam
biji)
• Sumber gizi (AA)
• Ikut mempertahankan keseimbangan
asam bara cairan tubuh
• Mempertahankan tekanan onkotik
Tabel. Jenis protein dan fungsinya dalam tubuh
Sifat Protein

• Kompleks (Sukar dipelajari)

• Dispers koloid
• Denaturasi = pengrusakan protein dapat dilakukan dengan:
• Alkohol
• Aseton
• Alkali
• Sinar X
• Sinar-UV
• Bersifat amfoter
• Mempunyai titik iso elektris
• Pd pH tertentu, sebagian bermuatan (+), sehagian bermuatan (-) netral
Protein
• Dpt dihidrolisis dgn:
• Asam
• HCl atau H2SO4 pekat (4-8 N) pd
suhu tinggi
• Alkali
• NaOH/KOH suhu tinggi, di atas 1
atm bbrp jam
• Enzim 9
 Asam/
Hidrolisis protein
•Asam Amino
•AA yg rusak

Alkali •Derivat AA

•AA

Enzim
•Polipeptida
•Metabolit intermediate
•Tdk ada AA yang rusak
•Tdk ada derivat AA

10
Protein

• Bila protein dihidrolisis akan dihasilkan zat-zat berikut:

• Protein  proteosa  pepton polipeptida  dipeptida asam
amino (disamping karbohidrat, purin, pirimidin)
• Proses hidrolisisi pada hewan dan manusia reversible‖
Komposisi kimia protein:

• Karbon 51%
• Oksigen 24%
• Nitrogen 16%
• Hydrogen 7%
• Belerang 0-3%
• Fosfor 0-3%.
• Atas dasar kadar nitrogen sebesar 16%, maka kandungan protein dalam suatu bahan makanan
dpt ditentukan .
Protein
Berdasar •Larut
Jenis
kanProtein
•Dlm sel
•Luar sel
kelarutan •Tdk larutprotein struktural
Protein larut di luar sel: banyak dan mudah diteliti

Protein plasma: > 300 jenis, kadar bervariasi

15
 Jenis Protein

Berdasarkan senyawa yg menyusun protein

Protein tunggal = Simple protein

Protein majemuk
Protein tunggal

• a. Albumin
• Contoh:
• Albumin telur, serum albumin, laktalbumin (susu), lekosin (gandum)
• Larut dalam air
• Kalau dipanaskan menggumpal
• BM 17.500-70.000
• Tidak mengandung glisin
Protein tunggal

• b. Globulin
• Contoh:
• Serum globulin, ovoglobulin (dari kuning telur), miosin (dari otot), dll
• Tidak larut dalam air
• Larut dalam garam encer
• Dalam larutan garam pekat (NaCl, MgSO4 (NH)4SO4)mengendap
• Kalau dipanaskan menggumpal
• BM 150.000
Protein Tunggal

• c. Glutelin
• Contoh:
• Glutenin (gandum)
• Orizenin (padi)
• Tidak larut dalam garam netral
• Larut dalam asam dan basa encer
Protein Tunggal

• d. Histonin
• Misal:
• Globin (dari Hb)
• Histon (dalam inti sel dan asam nukleat)
• Larut dalam air
• Tidak larut dalam NaOH
• Bila dipanaskan menggumpal
• Kalau ditambah asam encerlarut lagi
Protein Tunggal

• e. Protamin
• Misal:
• Salmin (ikan salmon), skrombin (ikan mackarel)
• Suatu polipeptida
• BM rendah (2000 -3000)
• Larut dlm air
• Tdk menggumpal kalau dipanaskan
• Sifat basa
• Mengandung banyak arginin
Protein Tunggal

• f. Skleroprotein = Albuminoid
• Misal:
• Elastin (ligamentum)
• Kolagen (tulang, tulang rawan)
• Keratin (tanduk, kulit ari, kuku)
• Larut dalam pelarut netral
2. Protein majemuk

• Terdiri dari ikatan asam amino dan senyawa lain

• a. Nukleoprotein
• Protein yang terikat pada asam nukleat
• Terdapat dalam inti sel
• b. Glikoprotein
• lkatan protein dengan karbohidrat (heksosa, heksoamina, dll)
• Misalnya : mucin (air ludah), ossen mukoid (tulang), tendo mukoid (tendon)
Protein majemuk

• c. Fosfoprotein
• Ikatan protein dengan asam fosfat
• Misalnya : kasein (susu), vitellin (kuning telur)
• d. Lipoprotein
• Ikatan protein dan lemak
• Dlm inti sel, darah, kuning telur, susu, serum, dll
• Juga dalam berbagai virus, antigen, bakteri dan trombosit
Berdasark
an bentuk

1. Globular
proteins

2.
Membrane
proteins
3. Fibrous proteins

• Berupa protein Struktural, al:

• Kolagen (jar ikat, tendon, tanduk)
• Keratin ( rambut, kuku, bulu, sutra)
• Elastin (pembuluh darah, ligamentum)
• Fibrinogen (gumpalan darah)
• Miosin (otot)
4.Khromoprotein

• Ikatan protein dan pigmen

• Contoh:
• Hb (pigmen darah)
• Ferritin (hati dan limpa)
• Khlorofil protein (pigmen hijau tumbuh-tumbuhan, mengandung Mg)
• Katalase, peroksidase dan cytokhrom (penting pada proses oksidasi
biologis)
Protein pd infeksi

• Protein fase akut:

• Kebanyakan dibentuk di hati
• Yang pertama muncul
• C-reactive protein (C-RP)
• α1-antichymotrypsin
• 12 jam pertama
• α1-acid glycoprotein
Protein fase akut

• Kemudian
• α1-antitrypsin
• Haptoglbin
• C4
• Fibrinogen
• Terakhir
• C3
• Ceruloplasmin
• Semuanya maksimal dlm 2-5 hari
Protein minor

• Beberpa protein minor plasma penting secara klinik:

• Ceruloplasmin
• C-reactive protein
• Prealbumin
• Protease inhibitor
• Dpt diukur dgn immunoassays
Metabolisme protein

• Protein diperoleh dari makanan

• Di GIT diuraikan  peptida-peptida  AA dgn bantuan enzim
• Di usus kecil AA diabsorpsi  darah  dibawa ke sel tubuh utk
digunakan mensintesis protein
• 1 – 2 % Protein tubuh di degradasi, terutama protein otot
• 75 % akan mengalami reutilisasi
Preanalitik

• Permintaan tes
• Persiapan pasien, identifikasi
• Pengambilan/pengumpulan BP
• Pengolahan
• Pengiriman
• Penyimpanan
 BAHAN
PEMERIKSAAN
CAIRA
N

NON-DARAH
TUBU
H DARAH
(PLEU
CAIRA
URINE
RA,
PERIT
N
SENDI
CSF WB SERUM PLASMA
ONIU
M,
PERIC
ARDIU
M) 34
Dpt dibagi dlm 5 kelompok:
1. Imunokimia
Metoda pemeriksaan protein
1. Utk protein spesifik menggunakan
antiserum (kuantitatif)
2.Mendeteksi dan Mengidentifikasi protein
abn
3.Pemisahan protein
1. Dgn Elektroforesis (sbg tes skrining,
semikuantitatif)
4.Pemeriksaan kualitatif
5.Pemeriksaan kuantitatif
1. Protein total, albumin, globulin
1
Imunokimia

• Mengukur kompleks Ag-Ab dgn:

• Nephelometry
• Turbidimetry
• Radial immunodiffusion
• Electroimmunoassay
• Utk protein yg kadarnya sangat rendah:
• Radioimmunoassay (RIA)
• Enzyme immunoassay (EIA)
2 Mendeteksi dan
Mengidentifikasi
Protein Abnormal
1.Radial Immunodiffusion (RID)
2.Immunoelectrophoresis (IEP)
3.Immunofixation electrophoresis (IFE)
3 Metoda utk memisahkan protein:

Column chromatography

Electrophoresis

Precipitation
Elektroforesis protein
• Memisahkan protein
menurut muatan elekriknya
(biasanya pd pH 8,6)
• Pem elektroforesis protein
dlm serum dan urine
terutama utk menapis
“monoclonal
gammopathies”
Elektroforesis protein

• Pd mulanya pemisahan prot dilakukan pd medium cair (lar elektrolit pd

pH 7.6)
• Dgn cara ini, protein dipisah menjadi 4 fraksi
• Albumin, α, β, dan ɣ globulin
Elektroforesis protein

• Pemisahan pd medium padat:

• Membran cellulose acetate
• Agarose gel
• Paling banyak digunakan
• Starch gel
• Polyacrylamide gel
• Bufer standar adlh barbital pd pH 8.6
• Jumlah sampel 3-5 µL
• Dgn metode ini protein dipisah menjadi 9 fraksi
Pola Protein utama dlm plasma dgn elektroforesis:

• Albumin
• α1-antitrypsin
• α2-macroglobulin
• Haptoglobulin
• β-lipoprotein
• Transferrin
• complement C3
• Fibrinogen , dan
• Immunoglobulins

Urutan dari Anoda ke katoda:

Presipitasi

• Utk metode turbidimetrik atau nephelometrik

• Presipitasi dilakukan dgn:
• Asam sulfosalisilat saja
• Na-sulfate
• Trichloroacetic acid
• Trichloroacetic acid saja
• Presipitat harus halus, merata dan homogen
• Metode ini sering digunakan pada pemeriksaan urine dan CSF
Presipitasi

• Utk memisahkan albumin dari globulin

• Dgn menambahkan:
• Na-sulfate
• Na-sulfite
• Ammonium sulfate
• Methanol
•  globulin akan dipresipitasi, albumin berada dlm larutan (supernatan)
Presipitasi

• Dgn mengukur total protein dlm BP dan mengukur protein dlm

supernatan/presipitat  maka Albumin/ Globulin dpt diukur.
• Metode presipitasi tdk seakurat metode elektroforesis
• Krn pd presipitasi:
• Bbrp α-globulin tdk mengendap saat dilakukan presipitasi  albumin
meningkat palsu
4 Pemeriksaan Protein Kualitatif:

Penentuan struktur
primer (asam Pengenalan protein Reaksi warna
amino)
Penentuan Struktur primer

• Dapat ditentukan dgn:

• 1. Hidrolisis protein
• Dgn asam kuat (mis 6N HCl), kmd jenis AA ditentukan dgn instrumen amino acid analyzer
• 2. Pemutusan sekuensial dari ujung-N terminal
• Metode degradasi Edman, hasil pemutusan diperiksa dgn HPLC
• 3. Kombinasi
• Cara digesti dgn tripsin dan spektrometri massa
• 4. Penentuan BM dgn spektrometri massa
• Reaksi Edman untuk
memotong dan
menderivatisasi asam
amino yang
terpenggal.
• Derivat asam amino
diidentifikasi
menggunakan
kromatografi atau
elektroforesis dengan
standar 20 asam
amino
PENGENALAN PROTEIN

• Protein akan mengendap bila + garam logam berat.

• Misal: CuSO4, Pb-Asetat, Mg(N03), dll
• Protein akan mengendap bila + pereaksi koloidal
• Misal: asam pikrat, asam tannat, dsb

1.Reaksi Pengendapan

• Protein + NaOH + Pb –AsetatPbS↓ (endapan hitam)

•
• Reaksi (+) protein berisi AA mengandung sulfur (Sistin)

2.Reaksi Sulfida
REAKSI WARNA

• Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat.
• Millon terdiri dari : Hg(NO3) + Hg(NO3)2 + HNO3.
• Protein + Millon endapan putih panaskan  warna merah
• Reaksi (+) untuk protein yg mempunyai gugus fenol atau hidroksifenil (mis tirosin)

1. Reaksi Millon
2. Reaksi Xantoprotein

• HNO3 pekat + lar protein endapat putih panaskan  kuning (pos)

• Protein + H2S04(p) warna kuning + alkali jingga
• Reaksi positif pd protein mengandung:
• Tirosin
• Fenilalanin
• Triptofan
• Dasar reaksi ialah nitrasi pada inti benzena dari molekul protein
3. Reaksi Hopkins-Cole

• Lar protein + reagen Hopkins-Cole, campur + H2SO4 perlahan cincin

ungu (pos)
• Reaksi positif bila protein mengandung triptofan
• Pereaksi Hopkins-Cole dibuat dari asam oksalat dengan serbuk
magnesium dalam air.
4.Reaksi Pauly

• Protein + asam diazobenzen-sulfonat  merah

• Reaksi (+) bila protein mempunyai AA tirosin dan histidin

5.Reaksi Ehrlich

• Protein + p-dimetil amino benzaldehida + HCl(p) biru  protein berisi

triptofan
6.Reaksi Folin-Ciocalteu's

• Protein + asam Fosfomolibdikfosfotungstat biru (tirosin dan triptofan

direduksi olh asam fosfomolibdikfosfotungstat)
• Reaksi positif bila protein mengandung Tirosin dan triptofan

7.Reaksi Sakaguchi

• Protein + α-Naftol + Natriumhipokhlorit merah (pos)

• Reaksi positif (warna merah) apabila protein mempunyai gugus guanidin
(mis. arginin)
8. Reaksi Natriumnitroprusida

• Lar protein + pereaksi Na-nitroprusida  merah (pos)

• Reaksi positif pd protein yg mengandung ggs-SH (mis. sistein)
• Pereaksi dibuat dari: Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak
9. Metode Biuret

• Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan

larutan CuSO4 encer.
• Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa amida
• Reaksi positif bila timbul warna merah violet atau biru violet.
Analisa Kuantitatif

• Digolongkan dlm dua metode:

• Konvensional
• Metode Kjeldahl t’dr: destruksi, destilasi, dan titrasi
• Metode titrasi formol
•  utk protein tidak terlarut.
• Metode modern
• Metode Lowry
• Metode spektrofotometri visible
• Metode spektrofotometri UV
•  Digunakan utk protein terlarut.
1. Metode Kjeldahl

• Utk penetapan N- total pd AA, protein, senyawa N lain

• Diasumsikan:
• Semua molekul protein adlh rantai polipeptida murni, ok nitrogennya kira-kira 16%
• Semua protein dlm serum secara kimia bereaksi sama (Sebenarnya tidk)
• Dlm keadaan asam, N dlm protein diubah menjadi ammonium ion.
• Sampel didestruksi dgn H2SO4, dikatalisis dgn katalisator yg sesuaidihasilkan
amonium sulfat
1. Metode Kjeldahl

• Lalu amonia yang terbentuk disuling, uap ditangkap larutan penyerap dan
ditetapkan secara titrasi
• Prosedur:
• Timbang 1 g bahan yg telah dihaluskan, masukkan dlm labu Kjeldahl (pd
protein tinggi, mis kedelai gunakan bahan kurang dari 1 g).
• Lalu ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml
asam sulfat pekat.
1. Metode Kjeldahl

• Prosedur :
• Panaskan semua dlm labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan teruskan
pemanasan sampai mendidih dan cairan jadi jernih. Stlh itu panaskan lagi kurang lebih 30
menit, matikan pemanasan dan biarkan sampai dingin.
• Kmd tambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan
beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya
tambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah
didinginkan dalam lemari es.
1. Metode Kjeldahl

• Prosedur :
• Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi.
• Panaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian
panaskan dengan cepat sampai mendidih.
• Destilasi ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida
0,1N sebanyak 50 ml dan indikator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5
tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.
1. Metode Kjeldahl

• Prosedur :
• Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml.
• Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat
dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N.
• Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari
merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.
Metode Kjeldahl

• Kadar Protein dihitung dgn persamaan berikut :

• Kadar = {(V NaOH blanko – V NaOH sampel)/berat sampel (mg)} x N NaOH
x 14,008 x 100% x Fk
• Keterangan : Fk = faktor koreksi; Fk N = 16
• Koreksi dilakukan thdp N yg berasal dari senyawa non-protein
• Perhitungan:
• Protein total = Nilai N amonia yg didapat (mis X) dikali 6.25 ( 100%/16%)
66
2. Lowry method

• Gabungan Biuret dan Folin-Ciocalteu

• Metode ini dpt mendeteksi protein pd kadar 10-60 µg/mL
• Banyak digunakan utk mengukur:
• Protein dlm jaringan
• Protein enzim dlm bhn yg telah dimurnikan
• Kurang cocok utk pengukuran protein dlm urine, LCS (krn bereaksi dgn senyawa non-protein)
• Kesalahan: 3-9 mg/dL
2. Metode Lowry

• Prosedur :
• Pembuatan reagen Lowry A :
• Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
• Pembuatan reagen Lowry B :
• Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N.
• Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium
natrium tartrat 2%.
2. Metode Lowry

• Prosedur :
• Penetapan Kadar
• a. Pembuatan kurva baku
• Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 μg/ml (Li).
• Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut :
• Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian
tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit.
• Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung
reaksi no.1 pada tabel di atas)
 No. Li (μL) Akuades
Tabung
1 0 1000
2 100 900
3 200 800
4 300 700
5 400 600
6 500 500
7 600 400
8 700 300
9 800 200
10 1000
70
0
2. Metode Lowry

• b. Penyiapan Sampel
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan
penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu
sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).
• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan
supernatannya. Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar
asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya
seperti pada kurva baku mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.
3. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)

• Prosedur :
• Pembuatan reagen Biuret:
• Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades
dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan
aquades sampai garis tanda.
• Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA):
• Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li).
• Penetapan kadar (Metode Biuret) :
• Pembuatan kurva baku :
• Dalam kuvet dimasukkan larutan induk, reagen Biuret dan aquades misal dengan komposisi sebagai berikut:
 Li Reagen Biuret Akuades Kadar BSA
(μL) (μL) (μL) (%)
20 800 180 0.1
30 800 170 0.15
40 800 160 0.2
60 800 140 0.3
80 800 120 0.4

73
3. Metode Biuret

• Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada λ 550 nm terhadap blanko yang terdiri dari 800
μL reagen Biuret dan 200 μL aquades.
• Cara mempersiapkan sampel :
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin
• Endapkan dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis
proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan).
• Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit,
pisahkan supernatannya.
3. Metode Biuret

• Cara mempersiapkan sampel :

• Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5
misal sampai 10,0 ml.
• Ambil sejumlah μL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika
perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif.
• Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm
terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5.
• Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam
kisaran absorban kurva baku.
4. Metode Spektrofotometri UV

• Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan fenilalanin
yang mempunyai gugus aromatik.
• Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin
mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm.
• Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih pendek.
• Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi konsentrasi protein
dalam larutan.
4. Metode Spektrofotometri UV

• Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam

nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm.
• Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh
asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang
ada dalam suatu tabel.
• Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x pengenceran
Absorption of UV light

• Pd λ280 nm, menghasilkan densitas elektron tinggi dari cincin aromatik

tyrosine dan tryptophan pd pH 8
• Asam urat dan bilirubin juga mengabsorpsi pd panjang gelombang tsb
End Point dgn Faktor, Increasing

• Absorbansi sampel (As) dibaca terhadap Blanko reagen

• Konsentrasi (Cs) = As x F

End Point dengan Standard, increasing

• AStd dan As dibaca thdp blanko reagen (nol)

• Cs = As/Astd x Cstd
End Poin dgn standard, decreasing

• Absorbansi blanko reagen (Abr), Std (Astd) dan sampel (As) dibaca terhadap Baseline
• Cs = (Abr – As)/(Abr – Astd) x Cstd.

Fixed Time dgn Faktor, Increasing or Decreasing

• Pengukuran Abs1 pertama stlh periode inkubasi (T1), Abs2 stlh interval ttt (T2)
• Cs = (Abs2-Abs1) x F

Fixed Time dgn Std, Increasing or Decreasing

• Cs = (Abs2-Abs1)/(Astd2-Astd1) x Cstd
Kinetik dgn Delta dan Faktor, Increasing maupun decreasing

• Pertama As dibaca thdp baseline stlh waktu ttt

• Pd interval waktu (tint) ttt (dlm detik) dibaca lagi
• Cs dihitung dgn mengalikan mean kenaikan Abs per menit (S) di kali F
• Cs = (S/N) x (60/tint) x F
• N : jlh interval
Makna Klinik

• Protein dlm plasma disintesis olh:

• Sel sel hati
• Sel plasma
• Kelenjar limfe
• Limpa
• Sutul .
• Protein total terdiri dari albumin dan globulin.
Makna Klinik

• Albumin disintesis di hati, berperan utama:

• Mempertahankan tekanan onkotik
• Sbg komponen Ab
• Hormon , enzim
• Faktor hemostasis
• Pertumbuhan
• Perbaikan jaringan
• Buffer pH
• Protein ada yg berikatan dgn bilirubin, asam lemak, obat, mineral.
Makna Klinik

• Rasio A/G dpt dihitung

• Albumin dpt menurun krn:
• Sintesis ↓ pd:
• Malnutrisi, malabsorpsi, gagal hati, ggn sintesis
• Kehilangan ↑ al:
• Proteinuria, akumulasi cairan asites, enteropathy
• Globulin dpt ↑ al pd:
• Sintesis non albumin ↑ krn:
• Penyakit akut atau kronik
Metode Pem protein total

• Metode Standar (WHO/IFCC)

• Biuret
• Prinsip: Ion kupri akan bereaksi dgn protein dlm suasana basa membentuk kompleks warna ungu.
Intensitas warna yg terjadi sebanding dgn konsentrasi total dlm sampel, dibaca pd λ 540 (546) nm.
• Tergantung adanya iktn peptida (tripeptida, oligopeptida) pd protein tsb. Dgn AA dan dipeptida tdk
bereaksi.
• Nilai rujukan:
• Dewasa : 6.3 - 8.5 g/dL
• Linearitas: sp 15 g/dL
Limitasi metode Biuret

• Hemolisis sp kadar Hb 184 μmol/L, lipemik kadar sp 7 mmol/L, bilirubinemia kadar sp 858 μmol/L tdk
mengganggu metode namun hrs menggunakan blanko sampel. Namun demikian yg terbaik menggunakan sampel
baru
• Hasil tinggi palsu pada 48 jam setelah penggunaan kontras warna bromophthalein dan juga pd pemasangan
tornikuet lebih dari 1 menit
• Hasil tinggi palsu pada hiperglikemia
• Protein total meningkat pd keadaan berikut:
• Mengkomsumsi obat-obatan: anabolik steroid, androgen, klofibrat, kortikosteroid, dekstran, epinefrin, GH,
progesteron, hormon tiroid, insulin, Na-heparin, Ca-heparin
• Dehidrasi, asidosis metabolik, infeksi/inflamasi kronis, MM
Limitasi metode Biuret

• Protein total menurun pada:

• Menggunakan obat-obatan:
• Senyawa ammonium, estrogen, obat sitotoksik, obat hepatotoksik, kontrasepsi oral,
alopurinol
• Keadaan:
• Sindroma malabsorpsi, Chron’s disease, NS, GN, asites, malnutrisi, hipervolemia,
gangguan membran kapiler, hipertiroidisme, DM tdk terkontrol, toksemia gravidarum,
disfungsi hepatis, syok traumatik
Limitasi metode Biuret

• Protein total urine meningkat pada:

• Mendapat obat: levodopa, metil dopa, Na2-cefotiksin, pemberian plasma gelatin base
• Protein total unrine menurun pada:
• Mengkomsumsi kalsium dobesilat
• Kadar protein total serum lebih rendah 4-8 g/dL bila darah diambil posisi pasien
berdiri.
• Kadar protein total plasma lebih tinggi 4% daripada kadar protein serum
Metode pem albumin

• Standar (WHO/IFCC)
• Bromcresol green (BCG)
• Prinsip: Dlm suasana asam (pH 4.1) albumin berikatan dgn BCG membentuk kompleks
warna biru hijau. Intensitas warna sebanding dgn kadar albumin dlm smpl, dibaca pd λ 630
(578) nm
• Linearitas: sp 7 g/dL
• Nilai Rujukan:
• Albumin: 3.8 – 4.4 g/dL (38 – 44 g/L)
Limitasi metode BCG

• Ikterus dgn kadar bil total sp 60mg/dL tdk mempengaruhi metode dgn menggunakan blanko sampel
• Hemolisis dgn kadar Hb sp 1000 mg/dL tdk berpengaruh
• Lipemik menggangu hsl pembacaan
• Spesifisitas menurun bila albumin rendah dan globulin tinggi
• Albumin meningkat pada: dehidrasi
• Albumin menurun pada:
• Malnutrisi, malabsorpsi berat, obstruksi intestinal, penyakit hati, demam rematik, kehilangan cairan ke
rongga tubuh, pemberian infus cepat dan berlebih, keganasan, gagal jantung kongestif, GGK, luka
bakar, SLE, kehamilan trimestes III, mendapat estrogen, bedrest berkepanjangan
Pemeriksaan Globulin

• Metode standard (WHO/IFCC)

• Metode: Biuret
• Prinsip:
• Biuret bereaksi dengan gamma globulin melalui ikatan peptide kompleks berwarna
violet.
• Intensitas warna sebanding dengan kadar gamma globulin dalam sampel diukur dgn
spektrofotometer.
• Nilai rujukan: Globulin: 2.3 – 3.5 g/dL
KETELITIAN DAN KETEPATAN

94
 PMI
95

PELAKSANAAN
∑ (Xi – X)2.
 BILA MENGGUNAKAN SD = ------------------
 BAHAN KONTROL UNASSAYED n-1
 PERIODE PENDAHULUAN
 PERIKSA BAHAN KONTROL 20 – 25 HARI KERJA
 HITUNG: MEAN, SD, CV, BATAS PERINGATAN (MEAN + 2 SD),
BATAS KONTROL (MEAN + 3 SD)
 NILAI MEAN, SD DIGUNAKAN UTK NILAI RUJUKAN PADA
PERIODE KONTROL
 PMI
96

• PELAKSANAAN
 PERIODE KONTROL
 UTK MENILAI PEKERJAAN KITA BAIK/TIDAK
 PERIKSA BAHAN KONTROL SETIAP HARI/SETIAP
PARAMETER DIPERIKSA
 CATAT NILAI TSB PADA FORMULIR PERIODE KONTROL

 HITUNG PENYIMPANGANNYA TERHADAP NILAI

RUJUKAN DALAM SATUAN SD DGN RUMUS:
 .

 . Xi - MEAN
SDi CV = SD/MEAN X
=----------------- 100%
SD
 PMI
97

PELAKSANAAN
 SATUAN SDi DIPLOT PADA KERTAS GRAFIK KONTROL
 SUMBU X PD GRAFIK, MENUNJUKKAN HARI/TGL
 SUMBU Y MENUNJUKKAN, SATUAN SDi YG DIPEROLEH
UJI KETELITIAN

• MEMERIKSA BAHAN KONTROL

• DISERTAKAN PD TIAP SERI PEM

UJI KETEPATAN (AKURASI)

• MEMERIKSA BAHAN KONTROL (ASSAYED CONTROL)

• DISERTAKAN TIAP 4 SERI

98
Ketelitian dan Ketepatan

• Pada pemeriksaan ketelitian

• Yang dianggap memenuhi syarat apabila:
• CV < 5% (untuk kebanyakan metabolit) dan
• CV < 10% untuk aktivitas enzim.
• Pada pemeriksaan ketepatan
• Yang dianggap baik, bila hasil pemeriksaan bahan kontrol ketepatan adalah:
• Nilai rerata ± 10% (untuk metabolit) dan
• Nilai rerata ± 20% untuk enzim.
KESALAHAN ACAK (RANDOM ERROR)

• PENYIMPANGAN: 1-3s DAN R-4s

• BERKAITAN DGN:
• PERUBAHAN PRESISI
• MENINGKATNYA SD ATAU CV
• PENYEBAB:
• ADANYA VARIASI DLM PELAKSANAAN TES
• PENANGAN REAGEN/PENYIAPAN
• DLM PEMIPETAN
• PENCAMPURAN REAGEN DGN SAMPEL
• KALIBRATOR DAN KONTROL TIDAK KONSISTEN

100
KESALAHAN ACAK (RANDOM ERROR)

• PENYEBAB:
• TEMPERATUR TIDAK STABIL
• VARIASI WAKTU
• ADANYA GELEMBUNG UDARA
• FLUKTUASI LISTRIK
• PENANGANAN MATERIAL ANTAR ANALIS TIDAK KONSISTEN
• BP TDK STABIL
• TDK DILAKUKAN PEM DUPLIKASI
• TERJADI DRIFF ATAU PENYIMPANGAN
• SENSOR TIDAK BENAR

101
KESALAHAN SISTEMATIK

• KESALAHAN BERUPA PENYIMPANGAN NILAI YANG DIPEROLEH DARI NILAI

SESUNGGUHNYA (BIAS).
• ADA DUA BENTUK
• CONSTANT SYSTEMATIC ERROR: MENYEBABKAN SATU GARIS YANG
TERPISAH DARI GARIS MEAN PADA GRAFIK KONTROL
• PROPORTIONAL SYSTEMATIC ERROR: PD GRAFIK BERUPA GARIS YG
MEMOTONG ATAU MEMBENTUK LERENG THDP GARIS MEAN.

102
KESALAHAN SISTEMATIK

• BERKAITAN DENGAN
• PERUBAHAN DALAM AKURASI
• PERGESERAN NILAI MEAN
• PERUBAHAN YANG KONSISTEN DALAM SISTEM / PROSES PEMERIKSAAN
• PERUBAHAN DALAM BIAS
• PENYEBAB/SUMBER KESALAHAN:
• PERUBAHAN LOT. NO REAGEN/KALIBRATOR
• SALAH MEMASUKKAN NILAI KALIBRATOR
• SALAH MENYIAPKAN LAR STD

103
KESALAHAN SISTEMATIK

• PENYEBAB/SUMBER KESALAHAN:
• LAR STD TDK STABIL/TERKONTAMINASI
• PERSIAPAN REAGEN KURANG TEPAT
• REAGEN / KALIBRATOR RUSAK
• PENYIMPANAN REAGEN / KALIBRATOR TIDAK SESUAI
• ALAT/PIPET SALAH (TDK DIKALIBRASI)
• TEMPERATUR SALAH
• SUMBER CAHAYA FOTOMETER TIDAK TEPAT
• PROSEDUR PENGUKURAN BERUBAH

104
SUMBER KESALAHAN SISTEMATIK

• Reagen blank tdk stabil

• Sampel blank tdk adekuat
• Penentuan nilai salah
• Alat tdk akurat, krn:
• Tdk dikalibrasi
• Dikalibrasi namun:
• Teknik kalibrasi tdk memadai
• Kalibrasi tdk linier
• Kalibrator yg digunakan tdk murni

105
KESALAHAN
106

• SISTEMATIK (SYSTEMATIC ERROR)

– PEMECAHAN
• PERIKSA JENIS PENYIMPANGAN YANG TERJADI UNTUK
MENENTUKAN JENIS KESALAHAN
• HUBUNGKAN JENIS KESALAHAN DENGAN PENYEBAB
POTENSIAL
• PERTIMBANGKAN FAKTOR-FAKATOR UMUM DALAM
MULTITEST SYSTEM YANG DAPAT MENYEBABKAN “OUT OF
CONTROL”.
– APAKAH TERJADI PADA VOLUME SAMPEL SEDIKIT ATAU
BANYAK
KESALAHAN
107

SISTEMATIK (SYSTEMATIC ERROR)

 PEMECAHAN
 APAKAH TERJADI PADA FILTER YANG SAMA
 APAKAH TERJADI PADA CARA DETEKSI YANG SAMA
(END POINT, KINETIK)
 APAKAH KESALAHAN TERJADI PADA TES-TES YANG
DIKALIBRASI ATAU DIVERIFIKASI
 HUBUNGKAN PENYEBAB DENGAN PERUBAHAN-
PERUBAHN YANG BARU DILAKUKAN
 VERIFIKASI TINDAKAN PERBAIKAN YANG TELAH
DILAKUKAN DAN DIDOKUMENTASI
AKURASI

• DPT DINILAI DGN MENGUKUR BHN KONTROL ASSAYED

• PERBEDAAN HASIL PENGUKURAN DGN NILAI AKTUAL DISEBUT BIAS
• Bias yg diperoleh dpt:
• POS (Lebih tinggi) atau
• NEG (Lebih rendah)
• D% = X – NA / NA x 100%

108
AKURASI DGN

• Perbandingan hasil pemeriksaan dengan sistem atau reagen kit lain dengan uji korelasi.
• Akurasi dapat pula dinilai dengan melakukan pemeriksaan bahan sampel yang telah
ditambahkan analit murni (Recovery = R), kemudian hasilnya dihitung terhadap hasil yang
diharapkan sebagai berikut:
• Hasil pemeriksaan (observasi)
• R (%) = ------------------------------------------- x 100%
• Hasil perhitungan (diharapkan)

109
 WESTGARD MULTIRULE SYSTEM
110

• 1-2s
– 1 NILAI KONTROL DI LUAR NILAI MEAN + 2SD,
PERINGATAN
• 1-3s
– 1 NILAI KONTROL DI LUAR NILAI MEAN ± 3SD,
MERUPAKAN PENOLAKAN, ADA KESALAHAN ACAK
• 2-2s
– 2 NILAI KONTROL BERTURUT-TURUT DI LUAR NILAI
MEAN ± 2SD; ATAU
– 2 NILAI KONTROL BERBEDA LEVEL BERADA DI LUAR
NILAI MEAN ± 2SD, MERUPAKAN PENOLAKAN, ADA
KESALAHAN SISTEMATIK
 WESTGARD MULTIRULE SYSTEM
111

• R-4s
– 1 NILAI KONTROL DI LUAR NILAI MEAN + 2 SD DAN 1
KONTROL LAIN DI LUAR MEAN – 2SD (SEHINGGA
PERBEDAAN NILAI JADI 4 SD) ATAU
– 2 NILAI KONTROL BERTURUT-TURUT + 2SD KEMUDIAN
– 2SD, MERUPAKAN KETENTUAN PENOLAKAN, KRN
KESALAHAN ACAK
• 4-1s
– 4 NILAI KONTROL BERTURUT-TURUT DI LUAR NIALAI
MEAN + 1SD ATAU MEAN – 1SD, MERUPAKAN
KETENTUAN PENOLAKAN, KRN KESALAHAN
SISTEMATIK
 WESTGARD MULTIRULE SYSTEM
112

10 (x)
 10 NILAI KONTROL BERTURUT-TURUT PADA SATU SISI
DI ATAS ATAU DI BAWAH NILAI MEAN, MERUPAKAN
KETENTUAN PENOLAKAN, KARENA KESALAHAN
SISTEMATIK
 PASCA ANALITIK

PENCATATAN & PELAPORAN

PERHITUNGAN

PENYALINAN

PENGIRIMAN

PADA ORANG YG TEPAT

WAKTU YANG TEPAT

113
THANK YOU
114