Produksi Protein Rekombinan:

Overproduksi, Isolasi,
Pemurnian, Karakterisasi
Lia Agustina
Teknologi Rekombinan
• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme berbeda 
merupakan fenomena umum di alam,
• Co: Corynebacterium diphteriae yang diinfeksi oleh virus β
menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap difteri,

Duplikasi fenomena alam ini di laboratorium,

Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi genetik
ke dalam suatu organisme,
 Teknologi DNA
Produksi rekombinan
Protein Gen pengkode protein,
Rekombinan misal: insulin
Contoh: Plasmid bakteri
insulin, Pemotongan dengan enzim
interferon, dll restriksi
Penggabungan antara gen yang
kita inginkan misalnya insulin
dengan plasmid/ vektor
Memasukkan plasmid ke dalam
sel dan seleksi sel yang
Isolasi mengandung plasmid
protein

Pemurnian
PLASMID BAKTERI
Plasmid Vector
• DNA untai ganda,

• Berbentuk lingkaran,

• Bersalinan tinggi,

• Berukuran kecil (mudah dimanipulasi),

• Dapat bereplikasi sendiri di dalam sel,

• Dapat disisipi DNA asing,

• Ada dua gen marker:

1. untuk mendeteksi adanya vektor;

2. untuk mendeteksi adanya DNA sisipan

ORI R-antibiotik MCS

 Vector

Vector
Molekul DNA yg digunakan sbg pembawa
untuk mengenalkan DNA asing ke dlm suatu
organisme.
Recombinant DNA  vektor yg mengandung
DNA asing.
4 jenis vektor  plasmids, viral vectors,
cosmids, dan artificial chromosomes.
MCS (multiple clonning site)
- Bagian DNA yg banyak sisi
pengenalan restriction enzyme
- tempat dimasukkannya DNA asing
ke dalam vector.
EcoR1

Origin of Replication (ORI)

Urutan DNA dimana replikasi diawali

Vector copy number  jumlah vektor yg

dihasilkan per-sel HindIII
1. Low copy number 25–50 kopi/sel
2. High copy number  150-200 kopi/sel.
BAGAIMANA MEMASUKKAN GEN KE DALAM PLASMID?
Pemotongan dan Penyambungan

ECOR1

Pemotongan 
Restriction Enzyme Penyambungan  Ligase
Digestion (RED)

DNA CLONNING
DNA ASING UDAH MASUK KE DALAM PLASMID

BAGAIMANA MEMASTIKAN KEBENARANNYA????

DNA SEKUENSING
 DNA ELONGATION (PERPANJANGAN)

Struktur
Sekuensing DNA
proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada
suatu molekul DNA.

Metode Sanger
DNA termination

DNA SEKUENSING
BAGAIMANA CARANYA MENSTIMULASI ‘MEMERINTAHKAN’
SEL BAKTERI UNTUK MENGHASILKAN PROTEIN YANG KITA
INGINKAN??
 Regulasi Ekspresi DNA Sisipan

Mekanisme yg digunakan dalam sel untuk meningkatkan atau

menurunkan produk gen spesifik (DNA / RNA / protein).

Penggunaan promotor kuat Protein dihasilkan dalam

jumlah banyak

Protein rekombinan yang dihasilkan

Awal transkripsi dapat toksik terhadap sel,
Tempat
menempelnya RNA
polimerase
Ekspresi gen perlu diregulasi,

Penggunaan promotor yang diregulasi.

 Operon Lac

= kelompok gen yg diperlukan untuk transport dan metabolisme

laktosa dalam E.coli.
Tdd 3 gen:
1. lacZ  β-galactosidase (LacZ): laktosa  glukosa + galaktosa
2. lacY  β-galactosidase permease: memasukkan laktosa ke
dalam sel
3. lacA  β-galactosidase transasetilase: mentransfer gugus asetil
dari asetil co-A ke β-galactosida.
 Operon Lac: represor, Induser

• Represor  menghalangi transkripsi dengan mengenali

operator  mencegah RNA polimerase berikatan dengan
promoter;

• Inducer (IPTG; lactosa sintetik)  berikatan dengan represor 

konformasi represor berubah  represor lepas dari operator
 RNA polimerase dapat mengkatalisa transkripsi
 BAGAIMANA MEMISAHKAN
PROTEIN YANG KITA INGINKAN
DARI PROTEIN E.COLI?

Isolasi

Pemurnian
 Isolasi Protein: Intrasel & Ekstrasel

Sumber protein (mikroba, tanaman, hewan)

Protein intraseluler Protein ekstraseluler

Isolasi sel
Pemisahan sel

Pemecahan sel
Pemekatan protein
Pemisahan serpihan sel

Pemekatan protein
 Pemurnian Protein

PEMURNIAN

Faktor penentu proses pemurnian Tingkat kemurnian yang

 sifat alamiah bahan baku dibutuhkan  tujuan penggunaan
(muatan, hidrofobisitas,  terapeutik dan diagnostik perlu
hidrofilitas, kemampuan mengikat) tingkat kemurnian tinggi.
 Pemurnian Protein

Pemurnian berdasarkan karakterisasi

protein target:
1.muatan (kromatografi penukar
ion),
2.ukuran dan bentuk (kromatografi
filtrasi gel),
3.hidrofobisitas (kromatografi
interaksi hidrofobik),
4.kemampuan pengikatan pada
ligan tertentu (kromatografi
afinitas).
BAGAIMANA MEMERIKSA KEBENARAN
PROTEIN YANG DIHASILKAN???
 Karakterisasi Protein

Kualitatif dan Kuantitatif:

1. Spektrofotometri UV  berdasarkan serapan asam-asam amino

aromatik seperti triptofan, fenilalanin, tirosin

2. Metoda kolorimetri: metoda Lowry  berdasarkan reaksi biuret

dengan copper (III) dan reduksi Folin ciocalteu phosphomolibdat-
phosphotungstat
Karakterisasi Struktur Primer Protein

1. Peptide mapping;
• Sekuensing ujung amino (N-terminal; 30);
• Sekuensing ujung karboksi (C-terbaca 3 asam amino);
2. Berdasarkan: bobot molekul (SDS-PAGE)
3. Muatan: isoelectric focusing (IEF);
4. Reaksi imunokimia (Western blot).
 2. PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis
Pemisahan protein berdasarkan
perbedaan kecepatan migrasi di dalam
media bermuatan listrik
Native Page/ Kondisi tidak
terdenaturasi
• Tanpa penmabahan SDS,
• Protein tidak terdenaturasi,
• Non-denaturing PAGE.
SDS-PAGE
Keadaan Terdenaturasi
• Protein didenaturasi-SDS;
tujuan: protein memiliki
ukuran yang seragam 
struktur liniear,
• Protein bermuatan negatif,
• Pada medan listrik: protein
bermigrasi ke kutub positif
• Jarak migrasi berdasarkan
berat molekul, membutuhkan
media berpori  gel
poliakrilamid
 Isoelektric Focusing
• Karakterisasi berdasarkan muatan total,
• Menggunakan gel poliakrilamid,
• Menggunakan gradien pH antara katoda dan anoda
menggunakan larutan amfolit,
• pI: pH dimana muatan total protein adalah nol,
• Muatan total nol  protein tidak bermigrasi ke medan listrik.
 Elektroforesis 2D

Gabungan dari IEF dan SDS-PAGE

Digunakan untuk karakterisasi

protein dengan berat molekul
sama tapi muatan berbeda,

Konfirmasi kemurnian protein 

dimensi pertama: IEF; dimensi
kedua: SDS-PAGE.
 Western Blot

Teknik untuk mendeteksi protein spesifik dalam sampel dengan menggunakan

antibodi yang spesifik

Pemisahan protein dengan SDS-PAGE

Protein dari gel yang sudah terpisah

berdasarkan ukuran akan ditransfer ke
membran PVDF

Deteksi dengan antibodi spesifik

 OVERVIEW MATERI HARI INI
Rekombinasi materi genetik merupakan kejadiaan umum di alam

Meniru proses tersebut di lab  plasmid, vektor, pemotongan

DNA dan penyambungan (ligasi); sekuensing DNA
Protein fusi  tujuan

Diperbanyak dengan menggunakan metabolisme bakteri 

operon lac

Isolasi protein
Pemurnian

Karakterisasi protein  SDS-PAGE; Isoelectric Focusing; Western

Blot