BIOLOGI MOLEKULER

KELOMPOK IV
ARYATI TELLENG
CLAUDIA KONDOY
FRANGKLIN BARAPA
NADIA UMBAS
 Restriction Fragment Length Polymorphism

2 4
Kelebihan &
Aplikasi RFLP
1 3 Kekurangan

Pengertian RFLP Tahapan RFLP

Pengertian RFLP
sebagai penduga variasi DNA.
RFLP merupakan Marka molekuler yang RFLP bersifat kodominan
Fungsi sehingga dapat mendeteksi
menggunakan enzim restriksi dalam adanya heterozigositas dan
mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA tidak diperlukan informasi
sekuens target

Analisis RFLP adalah salah satu teknik pertama yang secara luas
digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuens DNA.

Deteksi RFLP didasarkan pada adanya kemungkinan untuk membandingkan profil pita-
pita yang dihasilkan setelah dilakukan pemotongan oleh enzim restriksi terhadap DNA
target
APLIKASI RFLP
biasanya digunakan untuk :

Mendeteksi diversitas genetik, hubungan kekerabatan, sejarah

domestifikasi, asal dan evolusi suatu spesies, aliran gen dan seleksi,

Pengamanan gen-gen target yang akan diekspresikan

mengisolasi gen-gen yang berguna dari spesies liar serta mengkonstruksi

pustaka DNA

Mengidentifikasi perbedaan pada tingkat populasi, spesies, atau individu

TAHAPAN RFLP

Isolasi Dna

Pemotongan Dengan Enzim Restriksi

Elektroforensis Gel

Transfer DNA

Hibridisasi
ISOLASI DNA
Metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat dari suatu makhluk hidup.

Isolasi DNA merupakan kegunaan DNA untuk dianalisa atau dimanipulasi yang
harus diisolasi terlebih dahulu dan murni kandungannya.

Prinsip Kerja

dengan memecah, menghancurkan dan mengekstraksi

jaringan atau sel sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang
terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA.
TAHAP ISOLASI DNA
Proses perusakan atau penghancuran membran dan
Pelisisan dinding sel

seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar

Cara Fisik
dan pestle dalam nitrogen cair

menggunakan proteinase K untuk melisiskan membran

Cara kimiawi pada sel darah serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel

seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan

Cara Enzimatik lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel
TAHAP ISOLASI DNA
Memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan sehingga substansi yang lebih berat akan berada di
Sentrifugasi dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas

Ekstraksi bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel

o bertujuan untuk membersihkan nukleus sel dari kontaminan

seperti senyawa sekunder (fenol) dan polisakarida, RNA dan
juga protein.
Purifikasi o Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan
menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam
asetat berfungsi mendenaturasi protein , serta enzim RNAse
berfungsi melisiskan RNA dari ekstrak DNA tersebut
TAHAP ISOLASI DNA
Berfungsi untuk memisahkan senyawa DNA dari campuran
Sentrifugasi material dan komponen intraceluler yang mengandung
larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan karbohidrat

Bertujuan untuk mengendapkan protein, sehingga

Presipitasi untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat

Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan menggunakan isopropanol

dingin yang bertujuan agar DNA tersebut mengendap/mengumpul
sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral sisa
PEMOTONGAN DENGAN
ENZIM RESTRIKSI
DNA murni hasil isolasi
DNA akan dipotong dengan enzim
restriksi endonuclease yang akan
membentuk potongan DNA spesifik

Enzim-enzim ini bekerja dengan

Enzim Restriksi Endonuklease
memotong DNA pada lokasi -
memotong DNA tepat pada ikatan
lokasi spesifik yang mampu
fosfodiester
mengenali urutan nukleotida.
Hasil Pemotongan
Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung
kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Sticky end Blunt end

 bersifat lengket mudah untuk  bersifat tumpul dan sulit untuk
disambung. disambung
Faktor yang mempengaruhi kerja enzim restriksi

Suhu
Komposisi Buffer
pH

Waktu reaksi
Kekuatan ionik

Lama Inkubasi
Pengaruh kation
ELEKTROFORENSIS GEL
Suatu proses migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media
yang bermuatan listrik, dimana kecepatan migrasinya tergantung
pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul yang terlibat.

Prinsip dasar

Saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari

elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak
tertentu pada gel tergantung pada berat molekulnya
 TRANSFER DNA
 DNA yang telah diperoleh kemudian
ditransfer ke membran nitroseluloasa,
tahap inilah yang disebut dengan blotting.

 Salah satu metode tahapan transfer DNA

ke membran nitroselulosa yang
berdasarkan pada Prinsip Kapilaritas

 Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat

cair pada pembuluh, celah atau pori-pori
kecil

Proses transfer DNA dengan prinsip

kapilaritas
Fragmen-fragmen DNA hasil pemisahan pada gel
elekrtoforesis kemudian didenaturasi dengan larutan
bufer denaturan. Biarkan pada kondisi suhu ruang

Siapkan wadah dan baki, penyangga, pembatas,

batangan kaca, beberapa lembar membran filter seperti
membran 3M dengan ukuran yang telah ditentukan,
membran nilon, setumpuk kertas tisu yang punya daya
serap rendah, untuk memaksimalkan hasil transfer dari
larutan bufer, dan larutan bufer transfer.

Proses DNA transfer akan berlangsung dari bawah

ke atas, bufer akan diserap secara perlahan
sehingga DNA akan berpindah ke membran
secara sempurna.

Setelah proses transfer DNA berlangsung semalaman, maka

buang kertas tisu dan untuk melekatkan DNA secara kuat
lakukan cross-link dengan UV linker atau sinar UV panjang
gelombang 240 nm sekitar 2 menit. Setelah langkah ini,
membran siap untuk dilakukan prehibridisasi dan hibridisasi.
Proses transfer kapiler DNA dari gel agarosa ke membran
HIBRIDISASI
Proses identifikasi gen-gen hasil analisis RFLP dengan restriksi enzim yang sesuai
dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang spefisifik yang telah diberi label
baik dengan radioaktif maupun non radioaktif.

Teknik hibridisasi meliputi dua proses

Proses denaturasi atau pemisahan dua rantai asam

1
nikleat yang komplementer,

2 Proses denaturasi atau perpaduan kembali dua rantai

asam nukleat
 DNA terikat di
membran

Hibridisasi
dengan probe
spesifik
Probe berikatan
dengan fragmen
DNA target

Visualisasi
Proses sisanya
pada film
dicuci dari
hasil sinar-X
membran
 Kelebihan
 Dibutuhkannya DNA dengan kemurnian
 Menduga hubungan kekerabatan dari
yang tinggi dalam jumlah banyak
beberapa individu yang dianalisis,
 Tidak mungkin dilakukan otomatisasi
 Menduga ada tidaknya variasi genetik dari
koleksi plama nutfah  Pada beberapa spesies mempunyai level
polimorfisme yang rendah
 Memonitor proses seleksi (melalui linkage)
berbagai karakter  Sedikit lokus yang terdeteksi

 Memilah-milah komponen genetik dari  Memerlukan pustaka probe yang sesuai

karakter kuantitatif  Membutuhkan waktu yang banyak
 Menganalisis gen yang berasal dari proses  Membutuhkan biaya yang besar
transformasi genetik
 Memiliki kemampuan memisahkan yang
tinggi pada tingkat spesies, populasi.

Kekurangan
TERIMA KASIH