RESUME BIOLOGI SEL& MOLEKULER

Dosen:KristantiHerietrenggi,BSc,MBiomedSc

DISUSUN OLEH :

Nisma
(P3.73.34.1.22.121)

D-IIITLM(RegulerSore)

PROGRAMSTUDID-
IIITEKNOLOGILABORATORIUMMEDIKPOLTEKKESKEMENK
ESJAKARTAIII
 SUMBERDNADANTEKNIKISOLASIDNA/RNA

A. SUMBER DNA
● DNA dapat diisolasi dari sel berinti apa pun dari berbagai sumber sepanjang ada
materigenetiknya, baik yang hidup dan mati, seperti darah utuh, rambut, sperma, tulang,
kuku,jaringan, feses, bulu, kulit telur, air liur, sel epitel, urine, bakteri,jaringan hewan
atautumbuhan.
● MatodeisolasimempengaruhiDNAyangdibutuhkanuntukdiekstrasi.
● RNAdapatdiisolasidaridarah,sumsumtulang,selkultur,selbukal,jaringanpadat,jaringantetap,dankult
urbakteri.
● Pada isolasi RNA dengan single strain atau rantai tunggal akan mempengaruhi
hasilkarenatidakstabilmakadariitudibutuhkansampelyangsegar.
B.TeknikIsolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,lemak, dan
karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),ektraksi atau pemisahan
DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta Purifikasi ataupemurnianDNA.Langkahdasar:
1. Lisis(Sellisisataupenghancuransel)
dapatdilakukansecara
1. Secara mekanis dengan cara dihaluskan
dansonikasi(menggunakangelombangmurni)
2. SecarakimiawimenggunakanenzimdanlisisbufferLisisBuf
fer:
➔ Natriumdodesilsulfat(SDS):Untukmelarutkanmembransel
➔ ProteinaseK:Enzimuntukmendegradasiprotein
➔ NaCl,EDTA(iondivalen kelat yangdigunakan dalamaktivitas nuclease)
➔ TrisHCl(Buffer)
2. Purifikasi
Purifikasi untuk pemurnian DNA dari kontaminan (sisa-sisa) dan DNA/RNA recovery
ataupemulihanDNA
C.MetodeIsolasiDNA
1. Metode Isolasi Organik
Menggunakankombinasigaramberkonsentrasitinggi,pHrendah,dancampuranlarutanorgani
kfenoldanklorofom..Setelahlisissel,isiselulerdiasamkan,dan partikel dipelet dan
diekstraksi dengan fenol dan
kloroform.Emulsiiniakanterpisahmenjadiduafase.FaseairatasmengandungDNAyang
 dapat diendapkan dengan mencampurkan dengan etanol. Mengumpulkan
DNAyangdiendapkandengansentrifugasidanmensuspensinyakembalidalamvolume kecil
buffer atau air (50 hingga 250 µL) meningkatkan konsentrasi
DNAdariDNAyangdiisolasi.
2. Metode Isolasi Inorganik
Menggunakan kondisi dengan pH rendah dan garam berkonsentrasi tinggi
untuksecaraselektifmempresipitasiproteindanmeninggalkanDNAdalamlarutan.
3. Isolasi Solid Phase
Isolasi DNA pada media padat. Menggunakan matriks solid untuk mengikat
danmenahanDNAuntuktahappencucian.
4. Magnetic Bead
Prinsipnya adalah bahwa permukaan manik-manik magnetik membawa gugusreaktif
tertentu, gugus fungsi ini secara khusus dapat berikatan secara reversibeldengan asam
nukleat. Pada saat yang sama, daya tanggap magnet yang
dimilikiolehmanikmagnetitusendiridapatdenganmudahdipindahkandandiperkayadibawah
aksimedanmagnetluar,sehinggamewujudkanpemisahandanpemurnianasamnukleat.Magne
ticBeaddapatdigunakandalamekstrasimanual,tetapimetodeyangpalingumumdigunakandal
ammenggunakansistemisolasiDNAotomatis.
II. Teknik Isolasi RNA
1. Isolasi Orgamik
EkstraksiorganikdaritotalRNAmiripdenganDNA.Namun,RNAharusdilindungidariRNAse
intraselulerdanekstraseluler.
Tahap sel lisis untuk isolasi RNA dilakukan dalam detergen dan fenol
denganadanyagaramberkonsentrasitinggi(0,2hingga0,5MNaCl)atauRNAseinhibitor.
Guanidine isothiocyanate (GITC) merupakan agen denaturan RNasesdan dapat
digunakan menggantikan buffer berkonsentrasi garam tinggi.Larutanasam
fenol:kloroform:isoamyl alkohol (25:24:1) dapat mengisolasi RNA secaraefisien
2. Isolasi Solid Phase
● PemisahanRNAdengan solid phase dimulai dengan langkahyang sama
sepertipadaisolasiorganikDNA
● Kondisibufferyangkuatuntukdenaturasiharusdisesuaikansebelumlisatdimasukankedalamc
olumn(yangberisimembran)
III. Fungsi Reagen Terkait Protokol Pemurnian DNA Genomik Darah Mamalia

REAGEN FUNGSI

Penggunaan larutan buffer pada

prosesisolasi menggunakan Tris HCl dengan
pH 8.Fungsi larutan buffer adalah untuk
menjagastruktur DNA selama proses lisis
danpemurnian. Pada tahap akhir
pemberianbufferTEuntukmenjagaDNAterjaga
LisisBuffer(TE) selamapenyimpanan.

MengaturataumenstabilkanPHsuatularutan
TrisHCl
EDTA
MenonaktivkanenzimDNaseyangdapatmenden
aturasiDNA

1.Menjaga DNA agar tetap utuh

danmencegahprosesosmosisselamain
kubasi

2.Mengisolasi DNA virus

memungkinkanDNAgenomyangterisolasidala
mjumlahyang sedikit sehingga konsentrasi
yangdiperolehrendah
Lisis
Buffer(PBS MencegahdenaturasiDNA
)
Menstabilkankonsentrasiisoelektrolitdanrasio
1.NaCI
kandunganantarabasanukelotida
2.KCl
3.Na2HP04 BentuklarutanpenyanggadimanaNa2HPO4bert
4.KH2P04 indaksebagaibasa.

Larutanpenyanggaasam(bufferasam)yangberf
ungsiuntuklarutanpengencer

Untuk melisiskan membran

ProteinaseK sertamendegradasiproteinglobularmaupunr
antaipolipeptidadalamkomponensel.

MengendapkanDNA(Menurunkankonstantadie
Ethanol
lektrikair)

Untuk menghilangkan sisa-sisaprotein

yang menempel pada DNA
WashBuffer