ISOLASI DNA DAN RNA

DARI MIKROBA
Anggota Kelompok 5:
Chintami Aji Ningrum (E0018009)
Fiji Indah Gunawan (E0018016)
Fitri Lestari (E0018017)
Pathatun Khasanah (E0018032)
Reza Audrya Ashary (E0018034)
Zakiyah Aenurochmah (E0018050)
 Pengertian DNA dan RNA
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus,
mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA
nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan
protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas
berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.

Asam ribonukleat atau RNA adalah asam nukleat beruntai yang

tersusun atas monomer-monomer nukleotida dengan gula ribose.
RNA merupakan polimer yang disebut polinukleotida. Setiap
nukleotida tersusun atas tiga bagian yaitu basa nitrogen, gula
pentose dan gugus fosfat. Basa nitrogen pada RNA terdiri dari
adenine,guanine,sitosin,dan urasil. Urutan basa-basa nitrogen Struktur DNA & RNA
tersebut dapat mengkode infromasi genetic (Campbell,
dkk,2010:93).
ISOLASI DNA & RNA
Isolasi merupakan prosedur untuk memisahkan suatu bagian dari bagian lan
dengan tujuan tertentu (Singleton & Sainsbury, 2006). Isolasi DNA/RNA
merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika
sebelum melangkah ke proses selanjutnya.

Isolasi DNA merupakan salah satu teknik yang paling dasar dan penting dalam
studi DNA. Isolasi/ekstraksi DNA diperoleh dengan cara merusak atau
memecahkan dinding sel sehingga DNA keluar dari dalam sel. Isolasi RNA
memiliki tujuan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan
RNA murni. Prinsip isolasi RNA meliputi tiga hal, yaitu, melisiskan membran
sel untuk mengekspos RNA, Ekstraksi RNA, Pemurnian RNA, dan Presipitasi
RNA.
 TAHAPAN ISOLASI DNA

1. Pemecahan dinding sel atau jaringan yang akan diisolasi 5. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan
DNA dari bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 8.000- salah satu bahan kimia. untuk pemurnian DNA dari
10.000 rpm selama 10 menit. kontaminan protein digunakan enzim protease

6. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein

2. Debris sel dipisahkan dari dapat dilakukan dengan menggunakan densitas
larutan DNA. gradien sentrifugasi Cesium Chlorida (CsCl)

7. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan

3. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA menggunakan etanol dingin di bawah kondisi ionik yang
yang murni. kuat. Dan dicuci dengan EtOH (etanol) 70%.

4. Presipitasi DNA dengan etanol dingin 8. Pelet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau
ddH2O steril.
 METODE ISOLASI DNA

01
Metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (Wizard
02
Metode CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium
Bromide) dengan Phenol (Suharsono 2000 dalam Yustiati
Genomic DNA Purification, Promega). Metode ini
2006). Metode ini memiliki waktu pengerjaan cukup singkat
merupakan metode yang dikeluarkan oleh Promega
dimana pada proses presipitasinya digunakan penambahan
Corporation dan telah teruji hasilnya, namun disisi lain
P : C : I untuk memisahkan DNA dengan materi ikutan
biaya yang dibutuhkan cukup besar.
lainnya.

03
Metode modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium
Bromide) (Rogers dkk. 1997 dalam Mulyani 2003). Metode ini
memaksimalkan presipitasi DNA dengan menggunakan C : IAA secara
berulang yakni dua kali untuk mendapatkan DNA yang bebas dari
pengotor. Nilai konsentrasi DNA yang didapat relatif tinggi namun di
dalam pengerjaannya dibutuhkan waktu yang relatif lebih lama.
04
Metode ekstraksi DNA dengan thermal lysis (Buwono
dan Rosidah 2010). Metode ini memiliki waktu
pengerjaan yang sangat singkat. Namun dalam
pengerjaannya tidak melibatkan proses presipitasi dan
pencucian DNA melainkan hanya melakukan proses
ekstraksi DNA saja.
 ISOLASI DNA DENGAN SPESIMEN
BAKTERI
Isolasi DNA genom (kromosom)
bakteri Metode Boiling
Metode ini paling banyak digunakan, karena relatif
mudah, sederhana dan keberhasilan untuk memperoleh
isolat DNA cukup tinggi. Metode boiling merupakan
salah satu metode ekstraksi DNA sederhana dengan
memberikan gangguan fisik terhadap sel bakeri berupa
pemanasan dengan suhu tinggi (95-100˚C).
Isolasi DNA genom (kromosom) bakteri
menggunakan Metode Reagen KIT
Secara umum tahapan yang dilakukan ialah persiapan sampel,
lisis, pengikatan DNA, pencucian DNA, dan elusi DNA. teknik
Kit (Quick Extract Plant DNA Extraction). Kelebihan dari Metode
Kit ini adalah prosedur kerja yang simpel, proses pengerjaan yang
cepat, dan tidak menggunakan bahan kimia berbahaya seperti
kloroform dan memerlukan penanganan yang mudah. Metode Kit
tersebut hanya memerlukan satu jenis reagen dan dua kali inkubasi
tanpa proses penggerusan dan sentrifugasi.
 ISOLASI DNA PLASMID BAKTERI

Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan

menumbuhkan sel-sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan.
Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel
(ekstrak sel) keluar. Ekstrak sel ini kemudian dipurifikasi dengan
serangkaian perlakuan sehingga diperoleh DNA plasmid yang murni.
 METODE ISOLASI RNA
1. Metode
Prinsip kerja dariGuanidin Tiosianat
metode guanidine tiosianat
adalah melisiskan membran sel dan membuat
RNA larut di dalam larutan yang mengandung
guanidin tiosianat. Penambahan larutan fenol/
kloroform pada larutan guanidin tiosianat
dapat membuat pH larutan menjadi asam (pH
4). (Ausubel dkk, 2003).
2. Metode Modifikasi Guanidine Tiosianat
Isolasi RNA menggunakan prosedur ini
membutuhkan waktu selama 4 jam dan memberikan
hasil dengan tingkat kemurnian yang tinggi.
Prosedur ini direkomendasikan untuk sintesis cDNA
full-length dan reaksi RT-PCR. Metode ini juga bisa
dilakukan untuk mengetahui RNA total dari jaringan
atau kultur sel yang jumlahnya sedikit.
3. Metode Kromatografi Selulosa Oligo-
deoxytymine (DT)
Metode ini RNA Poli (A)+ dapat diisolasi dari RNA total
menggunakan seleksi selulosa oligo (dT) atau langsung dari
sampel jaringan dan kultur sel. Purifikasi mRNA dari RNA total
direkomendasikan untuk jaringan dan sel yang bersumber dari
bagian yang kaya RNase, sebagai upaya untuk meminimalisir
kemungkinkan degradasi RNA selama proses ekstraksi.
 CARA ISOLASI
RNA
Isolasi RNA bertujuan untuk memisahkan RNA dari zat lain sehingga dihasilkan
RNA murni. Prinsip isolasi RNA meliputi tiga hal, yaitu: ekstraksi, pemurnian,
dan presipitasi. Secara umum terdapat tiga dasar persyaratan isolasi RNA, yaitu:
melisiskan membran sel untuk mengekspos RNA; pemisahan RNA dari zat-zat
dan molekul lainnya seperti DNA, lipid, protein, dan karbohidrat; dan pemulihan
RNA dalam bentuk murni. Terdapat beberapa metode isolasi RNA yaitu metode
guanidine tiosianat, metode modifikasi guanidine tiosianat, metode kromatografi
selulosa oligo-deoxythymine (dT), metode trizol, dan metode langsung
menggunakan reagen kit.
 ANALISIS KUALITAS & KUANTITAS
DNA & RNA
1. Analisis Elektroforesis
Analisis dengan menggunakan elektroforesis dilakukan
pemisahan DNA dan RNA berdasarkan ukuran menggunakan
agar agarose 1 %. Gel direndam dalam campuran larutan
Tris-Borat-EDTA buffer dan etidium bromida. Visualisasi
dilakukan dengan sinar UV pada UV-transiluminator. Pita
DNA hasil elektroforesis yang semakin tebal belum tentu
berbanding lurus dengan tingginya konsentrasi DNA
(Sambrook, 1989).
2. Penyimpanan
Larutan DNA atau RNA dapat disimpan dalam bentuk aliquot
dalam suhu -200C atau -700C untuk menghindari kerusakan
karena pengulangan freeze-thawing. Atau jika memungkinkan
mengunakan nitrogen cair (-1960C). Untuk pemakaian sehari-
hari DNA dapat disimpan pada suhu 40C untuk beberapa bulan.
Hanya saja, jika DNA dilarutkan dalam air, kualitas DNA
tersebut dapat memburuk jika disimpan dalam suhu 40C (DNA
bersifat asam lemah dalam air).
TERIMA KASIH