BIOKIMIA LANJUT

Dosen : Prof. Sumaryati Syukur

REZA ELVINDA
NO BP. 2020412023
 DNA

DNA
(Deoxyribonucleic
acid) adalah asam
nukleat yang
mengandung
materi genetik dan
berfungsi untuk
mengatur
perkembangan
biologis seluruh
bentuk kehidupan
secara seluler.
 Isolasi DNA
Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam
deoksiribonukleat dari suatu makhluk hidup. Pertama
kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama
Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan
senyawa asam yang mengandung nitrogen dan fosfat
pada inti sel dari sel darah putih.] Senyawa ini diberi
nama nuklein, namun pada tahun 1889 muridnya yaitu
Richard Altmann menamainya asam nukleat. Metode
yang digunakan oleh Miescher adalah alkalyne lysis
untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA.
 Isolasi DNA

Prinsip Isolasi DNA adalah dengan memecahkan

dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan
terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA,
dan subtansi dasar lainnya.
 Macam-macam metode isolasi DNA

a. Teknik Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Teknik ini berdasarkan pada amplifikasi dari segmen-
segmen DNA acak yang menggunakan primer tunggal
yang sekuen nukleotidanya ditentukan secara acak.
Primer tunggal ini biasanya berukuran 10 basa. PCR
dilakukan pada suhu anealing yang rendah yang
memungkinkan primer menempel pada beberapa
lokus pada DNA. Aturan sederhana untuk primer
adalah terdiri atas 18-28 susunan basa dengan
persentase G+C 50-60%.
b. Metode CTAB
Menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan
dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena
adanya perbedaan karakteristik kelarutan
(differensial of solubility). Disamping deperoleh
fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan
diperoleh RNA dengan pita tipis yang terletak jauh
berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA
tergantung bahan yang diekstraksi.
c. Phenol: chloroform
Mengunakan senyawa Phenol-choloroform-isoamyl
alcohol, Metode standard untuk ekstraksi DNA, Akhir-
akhir ini ditinggalkan, karena sifat toksik phenol.

d. Salting out
Menggunakan garam konsentrasi tinggi (NaCl 6 M),
untuk medenaturisasi protein menggunakan
Proteinase K untuk denaturasi protein
e. Guanidineisothiocyanate
Metode ini lebih cepat dibanding dua metode
sebelumnya, Thiocyanate bersifat toksik, untuk lisis
dinding sel, Memerlukan chloroform untuk
denaturasi protein.

f. Silica Gel
Silica gel dapat mengikat DNA dengan perantaraan
garam/buffer tertentu (NaI), Cepat, tetapi recovery
DNA kurang.
 Tahapan isolasi DNA

1. Pelilisan • Untuk memecahkan dinding dan membran sel

• Untuk memisahkan hasil lisisan (dinding

2. Sentrifugasi sel, dan kloroform) dari DNA dengan
kecepatan tertentu.
• Untuk memisahkan senyawa DNA dari prot.ein,
3. Ekstraksi lipid dengan cara pengocokan

• Untuk memurnikan DNA dari kontaminan seperti

4. Puriikasi senyawa sekunder (fenol), polisakarida
• Untuk memisahkan hasil lisisan (dinding
5. Sentrifugasi sel, dan kloroform) dari DNA dengan
kecepatan tertentu.
6. Presipitasi • Untuk mengendapkan DNA
 Isolasi DNA Darah

Isolasi DNA darah dilakukan dengan melisisan sel darah

merah yang tidak mengandung DNA genom agar dapat
dipisahkan dari sel darah putih.
Tahapannya yaitu:

3. Presipitasi
2. Sel darah putih
1. Pelisissan garam
dilisiskan dengan
Sel darah merah DNA genom
deterjen anionik,
dipisahkan dari sel dipisahkan dari
untuk melarutkan
darah putih protein plasma
komponen seluler
dan inti
 4. DNA genom
diisolasi dengan
presipitasi
menggunakan alkohol
dan pelarutan
kembali

2. Dengan sel putih

2. Di dapatkan 3
lapisan dimana
1. Sampel sel darah 3. masing-masing
lapisan atas serum,
putih dipisahkan lapisan ditambahkan
lapisan tengan sel
dengan serum dengan PBS dan disimpan
darah putih, dan
sentrifugasi pada suhu -80°C
lapisan atas sel darah
merah
 Isolasi DNA Bakteri

Isolasi DNA bakteri dengan Polymerase Chain Reaction

(PCR). Tahpan proses Isolasi bakteri yaitu :
1. Sampel
2. Setelah
ditumbuhkan 3. Sampel jaringan
dimurnikan
pada media di ambil dan
beberapa kali isolat
BHIA (Brain dihancurkan
bakteri di ambil
Heart Infusion menggunakan
dengan ose steril
Agar) pada suhu gunting kemudian
disimpan dalam
28°C di uji PCR
free water
 Isolasi DNA Tanaman
Isolasi DNA tanaman dapat dilakukan dengan metode
CTAB yang dimodifikasi sebagai protokol yang efisien
untuk membuang polisakarida dan phenol. Tahapan
isolasi DNA tanaman yaitu :

1. Sampel di 2. Kemudian
3. Diinkubasi pada
tambahkan CTAB sampel digerus
suhu 60°C selama
dan dicuci dengan dengan nitrogen
30 menit dan di
PCI kemudian di cair dan
sentifuse 10 menit
inkubasi -20°C ditambahkan buffer
ekstrak
 6. Volume
4. Supernatan 5. Dipindahkan ke
supernatan
ditambahkan CI tabung ependof
mixgentle dan
dan disentrifuse baru dan
ditambahkan
4°C selama 5menit ditambahkan
alkohol absolut dan
amonium sulfat
dikocok

9. Kemudian
8. Kemudian di
7. Di inkubasi ditambahkan buffer
ambil pelet di
-20°C selama 2 TE dan DNA
tambhakan alkohol
jam dan di sampel tanaman
70% dan
sentifuse 15 menit siap di simpan pada
disentrifuse selama
pada suhu 4°C suhu 20°C untuk
1 jam
jangka waktu lama
Jurnal Isolasi DNA Tanaman
 Isolasi DNA amplifikasi PCR daerah ITS rDNA fungsi Endofit
Umbi Dahlia (Dahlia variabilis) LBKURCC69

a) DNA yang di isolasi adalah umbi tanaman dahlia (Dahlia

variabilis)
b) susunan basa yang digunakan dalam amplifikasi PCR pada
daerah ITS-1 dan ITS-2 rDNA dilakukan menggunakan
pasangan primer ITS-4 dan ITS-5 dengan suhu annealing 45°C.
Primer ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) dan ITS5
(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’).
c) Hasil dari amplifikasi diketahui dengan adanya pita-pita DNA
pada gel agarosa setelah dilakukan elektroforesis.
HASIL
 Kesimpulan

1. DNA kromosomal fungi endofit LBKURCC69 berhasil

di isolasi dari miselia fungi berumur 4 hari dengan berat
molekul 6124 pb
2. Amplifikasi PCR pada daerah ITS-1 dan ITS-2 rDNA
dapat dilakukan menggunakan pasangan primer ITS4
dan ITS5 dengan suhu annealing 45ºC
3. Hasil amplifikasi PCR menghasilkan fragmen DNA
sebesar 537 pb