ISOLASI DNA EPHITHELIAL MULUT

1. Dwi Susilowati / 15030194039

2. Devita Diah A. / 15030194053
3. Fawzia Aulia P. / 15030194071
Tujuan :
• Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai
prosedur, dengan sampel DNA diambil dari sel
ephitelial mulut
Beberapa metode isolasi DNA :
• Teknik Random Amplified Polymorphic DNA
(RAPD)
• CTAB
• Phenol:chloroform
• Salting out
• Guanidine isothiocyanate
• Silica Gel
• PCR
Metode yang digunakan
CTAB
(cetyl-trimethyl-ammonium bromide)
Kelebihan :
1. Hasil visualisasi berupa pita DNA yang tebal dan terang ditunjukkan oleh
sampel DNA yang diisolasi dengan metode CTAB yang dimodifikasi.
Mulyaniet al (2011) menyatakan bahwa sampel DNA yang tervisualisasikan
sebagai pita yang terang dan tebal memiliki konsentrasi dan tingkat
kemurnian tinggi
2. Dibandingkan dengan menggunakan DNA isolasi KIT, CTAB lebih murah
3. Dibandingkan dengan fenol-chloroform. Metode CTAB lebih aman karena
fenol bersifat toksik.
Dasar Teori
• DNA adalah asam nukleat yang mengandung
materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan. DNA terdapat di nukleus,
mitokondria dan kloroplas.
Prinsip dasar isolasi DNA adalah :
1. Isolasi jaringan
2. Lisis membrane sel
3. Ekstraksi DNA
4. Purifikasi DNA
5. Presipitasi DNA
 Salah satu metode untuk mengisolasi
DNA adalah metode CTAB (cetyl-trimethyl-
ammonium bromide).
CTAB adalah detergen yang berfungsi
dalam lisis DNA. CTAB dapat memisahkan
polisakarida dari DNA karena perbedaan
kelarutannya. Polisakarida dapat
menghambat aktivitas enzim pada proses
lanjutan penggunaan DNA (misal PCR).
 Alat dan Bahan

Alat Bahan
1. Tabung 1. Epitel pada rongga mulut
mikrosentrifus 2. Buffer lysis CTAB
2. Mikropipet dan tips 3. Tris EDTA
3. Gelas kimia 4. Etanol dingin
5. CIA
4. Mikrosentrifus
(Chloroform:isoamil alcohol
5. inkubator
24:1)
Alur :

• Pengumpulan sel
Ambil minuman isotonik  10 mL dan
digunakan berkumur selama 1 menit. Hasil
kumuran ditampung ke dalam gelas kimia,
yang kemudian larutan tersebut akan
digunakan sebagai sel epitel untuk isolasi
DNA. Ulangi berkumur dengan akuades dan
air mineral dengan langkah yang sama.
 Pemecahan sel (lisis sel)
• Ambil 1,5 mL sampel dipindahkan ke tabung
mikrosentrifuse
• Tambahkan 600l buffer ekstraksi (CTAB)
• Rendam tabung mikrosentrifuse di dalam water bath
dengan suhu 650C selama 10 menit dan diinkubasi
kembali selama 5 menit pada suhu ruang
• Sampel disentrifugasi pada mikrosentrifuse dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 30 detik
• Supernatant dibuang kemudian endapan ditambahkan
sel lagi hingga 2 kali
Ekstraksi DNA
• Endapan ditambahkan 1 mL Tris EDTA ke
dalam tabung mikrosentrifuse
• Ditambahkan 700l CIA ke dalam sampel dan
dibolak-balik secara perlahan untuk mencampur
• Vortex tabung mikrosentrifuse selama 30 detik
Pengendapan
• Ditambahkan dengan 1 mL etanol dingin
• Biarkan selama 5 menit
• DNA akan menggumpal (terlihat ada yang
melayang-layang seperti benang putih)
Pada proses lisis
• Lisis membran sel yaitu proses untuk
meluruhkan membran sel pada nukleus. Teknik
ini umumnya dilakukan menggunakan larutan
deterjen kationik yaitu CTAB. Hal ini
dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat
serta tahapan metode yang relatif lebih mudah.
• Penggunakan CTAB berfungsi untuk
mengurangi kontaminan,
mengurangi browning dan untuk menjaga DNA
agar tidak rusak.
• Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga
struktur DNA selama proses penghancuran dan
purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta
mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA
dan mencegah perubahan pada molekul DNA.
Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer,
dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan
penambahan inhibitor DNAase dan detergen
(Surzycki 2000).
Pada ekstraksi DNA
• (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim
DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang
diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara mengikat ion magnesium dan
kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor
enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008)
• Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan
untuk menghilangkan beberapa kontaminan
seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida,
RNA dan juga protein. Pemurnian dari
kontaminan protein dan RNA dilakukan
menggunakan senyawa kloroform
isoamilalkohol.
• Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan
menggunakan etanol dingin yang bertujuan agar
DNA tersebut mengendap/mengumpul sekaligus
memisahkannya dari garam-garam mineral sisa
CTAB.
Bibliography
Mulyani, Y., & Nurruhwati, I. (2011).
Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA
untuk Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV)
pada Ikan Mas (Cypirinus carpio L). Jurnal
Akuatika, 1-16.
TIM. (2017). Petunjuk Praktikum Biokimia.
Surabaya: UNESA Press.