PANDUAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

Disusun oleh:
Tessa Fauziah, S.Si., M.Si.

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS SINGAPERBANGSA KARARWANG
2023
 ISOLASI DNA
I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu menjabarkan tahapan isolasi DNA
2. Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA

II. Dasar Teori

Ekstraksi atau isolasi DNA yang memiliki kualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang
harus dipenuhi dalam studi molekuler (Ardiana, 2009). Teknik molekuler DNA, terutama yang
didasarkan pada polimerase chain reaction (PCR), membutuhkan tahap isolasi DNA genom
dengan kualitas yang baik. Salah satu tantangan dalam isolasi DNA dari tanaman adalah
kandungan polisakarida, polifenol dan metabolit sekunder lainnya yang dihasilkan oleh
tanaman. Komponen-komponen ini dapat menghambat proses pemurnian DNA dan
penggunaannya lebih lanjut dalam studi molekuler. Penghilangan kontaminan tersebut
membutuhkan protokol rumit dan memakan waktu (Aboul-Maaty dan Oraby, 2019).
Adapun prinsip isolasi DNA ialah memisahkan DNA genom dari komponen-komponen sel
lainnya. Pada tahap pertama (lisis), membran sel dan dinding sel dilisiskan atau dihancurkan
dengan menambahkan detergen (misalnya Sodium dodecyl sulphate (SDS), Cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB)) untuk membebaskan isi sel. Pada tahap kedua, DNA
dipisahkan dari komponen lainnya yang merupakan kontaminan seperti polisakarida dan
protein. Pada tahap ketiga, pemurnian DNA, DNA dipresipitasi menggunakan etanol atau
isopropanol sehingga DNA terpisah dari residu-residu kontaminan yang masih tersisa (Triani,
2020).
Metode yang paling umum digunakan dalam isolasi DNA genom tanaman yang banyak
mengandung polisakarida dan senyawa polifenol adalah Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
(CTAB). Disebut metode CTAB karena menggunakan CTAB dalam proses lisisnya. CTAB
merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein,
memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan DNA. Metode ekstraksi
DNA dengan CTAB dapat menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan dapat
memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan karakteristik kelarutan.
Kelebihan lainnya menggunakan metode CTAB yaitu tidak membutuhkan biaya yang
mahal, lebih murah dibandingkan dengan menggunakan kit (Triani, 2020).
III. Metode
III.1 Alat dan Bahan
Alat Bahan
1. Lumpang dan alu 1. Jaringan daun padi sebanyak…
2. Water bath atau dry bath 2. Nitrogen cair
3. Microtube 2 ml & 1,5 mL 3. CTAB 10%
4. Rak microtube 4. NaCl 5M
5. Microcentrifuge 5. EDTA 0,5 M
6. Micropipet 6. Tris-HCl 1M
7. Tip 7. 2-mercaptoethanol
8. Vortex 8. Pvp40
9. Kulkas -20 9. 0,5 M NH4Ac
10. Ice box 10. Tisu
11. Spidol ukuran F water-proof
12. kloroform:isoamil alkohol (C:I) 24:1
13. Isopropanol
14. Etanol 70%
15. Nuclease-free water (NFW)
16. es
III.2 Prosedur
Tahapan isolasi DNA genom dari tanaman berikut mengikuti protokol dari Doyle & Doyle
(1987) dengan modifikasi.
1. Dokumentasikan setiap langkah dalam praktikum ini.
2. Buat 600 uL CTAB isolation buffer dalam microtube 2 mL dengan komposisi seperti
berikut.
Tabel 1. Kompisisi CTAB isolation buffer
No. Komponen Konsentrasi Konsentrasi Vol. yang
akhir stok ditambahkan
1 CTAB 2% 10% 120 uL
2 EDTA pH 8.0 20 mM 0,5 M 24
3 Tris-HCl pH 8.0 100 mM 1M 60
4 NaCl 1,4 M 5M 168
5 2-mercaptoethanol 0,2 % 1,2 uL
6 PVP40 100 mg/g sampel 50 mg
7 Deion 228 uL
Total volume 600 uL
3. Panaskan CTAB isolation buffer pada suhu 65oC dalam water bath atau dry bath.
4. Gerus 0,5 gram jaringan daun padi menggunakan lumpang dan alu serta nitrogen cair
mortar hingga halus berbentuk powder atau bubuk.
5. Masukan sampel bubuk ke dalam microtube 2 mL berisi CTAB isolation buffer (poin 1)
6. Inkubasi homogenate pada suhu 65oC selama 30 menit, setiap 10 menit dihomogenkan
menggunakan vortex selama 1 menit.
7. Setelah itu, tambahkan kloroform:isoamil alkohol (C:I) 24:1 sebanyak 1 volume larutan
sampel (±600 uL).
8. Vortex homogenat selama 2 menit.
9. Setelah itu, sentrifuga selama 20 menit pada suhu 4o C, 6000 rpm.
10. Pindahkan supernatan (bagian cairan paling atas) ke microtube 2 mL baru dengan perlahan
menggunakan mikropipet 100 uL.
11. Tambahkan 1 volume 0,5 M NH4Ac (±600 uL) dan isopropanol dingin (±600).
12. Inkubasi selama 1 jam pada suhu -20ºC.
13. Setelah inkubasi selesai, sentrifuga pada suhu 4ºC, 6000 rpm selama 20 menit, untuk
memperoleh pelet DNA.
14. Buang supernatan dan cuci pelet dengan menambahkan 200 uL etanol dingin 70% dan
sentrifuga pada suhu 4ºC, 6000 rpm selama 20 menit.
15. Tandai pelet di microtube dengan spidol lalu kering anginkan pelet dengan membalikan
microtube diatas tisu dan dibiarkan 10-15 menit terkena udara agar etanol hilang.
16. Larutkan pelet DNA dalam 30 µL NFW.
17. Simpan isolat DNA pada suhu -20ºC jika untuk analisis selanjutnya.

Referensi
Aboul-Maaty, N.AF., Oraby, H.AS. Extraction of high-quality genomic DNA from different
plant orders applying a modified CTAB-based method. Bull Natl Res Cent 43, 25 (2019).
https://doi.org/10.1186/s42269-019-0066-1
Ardiana, Dwi Wahyuni. 2009. Teknik Isolasi Dna Genom Tanaman Pepaya Dan Jeruk Dengan
Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 (1), 12-16.
Doyle, J.J. and J.L. Doyle. (1987): A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochem. Bull., 19, 11-15.
Triani, N. (2020). ISOLASI DNA TANAMAN JERUK DENGAN MENGGUNAKAN
METODE CTAB (CETYL TRIMETHYL AMMONIUM BROMIDE). G-Tech: Jurnal
Teknologi Terapan, 3(2), 221–226. https://doi.org/10.33379/gtech.v3i2.419