LAPORAN PRAKTIKUM MATA KULIAH BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

Ditulis untuk Memenuhi Tugas Praktikum Mata Kuliah Biologi Sel dan Molekuler

Tanggal Praktikum : Rabu, 24 November 2021

Waktu Praktikum : 08.00 WITA – 17.00 WITA

OLEH :

PROGRAM STUDI SARJANA TERAPAN

SEMESTER III

KELAS A

NI PUTU ANANDA YULIASTRI DEWI

P07134220033

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

2021
 LAPORAN PRAKTIKUM I

EKSTRAKSI DNA (FESES)

I. Materi Praktikum : Ekstraksi DNA (feses)

II. Prinsip
Ekstraksi dan purifikasi DNA pada dasarnya merupakan serangkaian proses
pemisahan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Ekstraksi DNA pada
organisme eukariot dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell
wall), penghilangan protein dan RNA (cell digestion), dan pengendapan DNA
(precipitation) dan pemanenan. Saat ini isolasi DNA secara teknis menjadi lebih
mudah dengan munculnya berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi dalam bentuk
kit. Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi dan atau purifikasi DNA dari suatu sel
sebagai tahap awal suatu analisis genetik. Isolasi DNA diperlukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.
III. Metode : QIAamp Power-Fecal DNA kit
IV. Pendahuluan
Biologi sel dan molekuler merupakan bidang ilmu yang terus menerus
berkembang. Baik dalam bidang medis untuk menangani kelainan-kelainan genetik
dan penemuan obat-obat baru, pada bidang pertanian, peternakan, kehutanan untuk
meningkatkan produk-produk baik tanaman maupun hewan unggul serta di bidang
lingkungan dalam hal mengatasi polutan dan perannya dalam kemajuan produksi
pangan. Sejalan dengan perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, seluruh
unit kegiatan manusia tidak bisa terlepas dari analisis tingkat molekuler yang
melibatkan asam nukleat (DNA).
Isolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) merupakan teknik yang penting dalam
pengembangan ilmu ini. Derajat kemurnian dan konsentrasi dalam isolasi DNA
sangat mempengaruhi hasil yang diperoleh. Analisis tingkat molekuler dengan
DNA sebagai objeknya diawali dengan proses isolasi DNA, selanjutnya diikuti
analisis molekuler, seperti PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), dan RAPD (Restricted Amplified
Polymorphisms). Keberhasilan proses isolasi DNA ditentukan oleh tiga hal penting,
yaitu kemurnian DNA 1.8-2.0, keutuhan DNA dan konsentrasi tinggi (Clark, 1997).
 DNA total yang dihasilkan dari proses isolasi DNA dari sel hewan terdiri atas.
DNA inti dan DNA mitokondria. DNA inti merupakan komponen penyusun gen
yang berada dalam lokus kromosom di dalam inti sel. Pada prinsipnya isolasi DNA
dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun,
daging buah, serangga, kalus, akar, batang, daging dan sisik ikan. Hal ini sesuai
dengan Muladno (2002) yang menyebutkan bahwa setiap sel pada tubuh makhluk
hidup terdapat DNA yang bisa diekstraksi dari ujung rambut sampai ujung kaki
seperti daging, darah, sperma, ginjal, jantung, hati dan limpa. DNA (asam nukleat)
merupakan elemen penting pada seluruh organisme yang berperan mengatur
seluruh aktivitas hidup.
V. Alat dan Bahan
a. Alat :
 Mikrosentrifugasi
 Mikropipet (60 mikroliter- 750 mikroliter)
 Bluetick tip, yellow tipe, white tip
 Tissue
 Spidol
 Vortex
 Kulkas
 Timbangan
 Batang Pengaduk
 Beaker glass
 Aluminium foil
 Biosafety Cabinet level 3 (B)
 Buku Pegangan Kit DNA QIAamp PowerFecal
b. Bahan :
 Feses
 Reagen dan komponen QIAamp PowerFecal DNA Kit yang berisi :
1. Tabung Manik
2. Solusi Power Bead 42 ml
3. Kolom Putar MB 50
4. Solusi C1 : 6,6 ml
 5. Solusi C2 : 15 ml
6. Solusi C3 : 15 ml
7. Solusi C4 : 72 ml
8. Solusi C5 : 30 ml
9. Solusi C6 : 9 mm
10. Tabung Pengumpul
VI. Prosedur
1. Tambahkan 0,25 g feses atau biosolid ke dalam Bead Tube yang disediakan.
Catatan : Untuk sampel tinja yang sangat tinggi lipid, polisakarida, dan
protein (misalnya mekonium atau beberapa kotoran burung), sejumlah kecil
bahan awal (~0,10 g) dapat meningkatkan hasil dan kemurnian DNA.
2. Tambahkan 750 l Power Bead Solution ke Bead Tube.
3. Tambahkan 60 l Solution C1 dan balikkan beberapa kali atau vortex sebentar.
4. Panaskan tabung pada 65°C selama 10 menit.
5. Amankan tabung secara horizontal menggunakan Adaptor Vortex (cat. no.
13000–V1–24). Vortex dengan kecepatan maksimum selama 10 menit.
6. Sentrifugasi tabung pada 13.000 x g selama 1 menit.
7. Pindahkan supernatan ke dalam Collection Tube 2 ml yang bersih
(disediakan). Harapkan antara 400 hingga 500 l supernatan.
8. Tambahkan 250 l Solution C2 dan vortex sebentar hingga tercampur. Inkubasi
pada suhu 2-8°C selama 5 menit. Catatan: Anda dapat melewatkan inkubasi 5
menit. Namun, jika Anda telah memvalidasi ekstraksi PowerFecal dengan
inkubasi, kami sarankan Anda mempertahankan langkah tersebut.
9. Sentrifugasi tabung pada 13.000 x g selama 1 menit.
10. Hindari pelet, pindahkan hingga 600 l supernatan ke dalam Collection Tube 2
ml yang bersih.
11. Tambahkan 200 l Solution C3 dan vortex sebentar. Inkubasi pada suhu 2-8°C
selama 5 menit.
Catatan : Anda dapat melewatkan inkubasi 5 menit. Namun, jika Anda
telah memvalidasi ekstraksi PowerFecal dengan inkubasi, kami sarankan Anda
mempertahankan langkah tersebut. 10 QIAamp PowerFecal DNA Kit Buku
Pegangan 08/2017.
 12. Sentrifugasi tabung pada 13.000 x g selama 1 menit.
13. Hindari pelet, pindahkan supernatan ke dalam Collection Tube 2 ml yang bersih
(disediakan).
14. Tambahkan 1200 l Larutan C4 ke supernatan dan vortex selama 5 detik.
15. Muat 650 l supernatan ke dalam Spin Column MB dan sentrifus pada 13.000 x
g selama 1 menit. Buang flow-through dan ulangi sampai semua supernatan
telah diproses.
Catatan : Setiap sampel yang diproses akan membutuhkan total tiga
beban.
16. Tambahkan 500 l Solution C5 dan sentrifus selama 1 menit pada 13.000 x g.
17. Buang flow-through dan sentrifus lagi selama 1 menit pada 13.000 x g.
18. Tempatkan MB Spin Column dengan hati-hati ke dalam Collection Tube 2 ml
yang bersih (tersedia). Catatan: Hindari memercikkan Solusi C5 apapun ke
Kolom Putar MB.
19. Tambahkan 100 l Solution C6 ke tengah membran filter putih. Sebagai
alternatif, Anda dapat menggunakan air steril, bebas DNA, tingkat PCR (cat.
no. 17000-10) atau buffer TE.
Catatan : Elusi dengan 100 l Larutan C6 akan memaksimalkan hasil
DNA. Untuk DNA yang lebih pekat, minimal 50 l Solusi C6 dapat digunakan.
20. Centrifuge pada 13.000 x g selama 1 menit dan buang MB Spin Column. DNA
dalam tabung sekarang siap untuk aplikasi hilir.
Catatan : Kami merekomendasikan penyimpanan DNA beku (–20°C
hingga –80°C) karena Solusi C6 tidak mengandung EDTA. Untuk memusatkan
DNA, lihat Panduan Pemecahan Masalah.
VII. Hasil dan Dokumentasi
VIII. Interpretasi Hasil
Ekstraksi DNA murni dengan Kit QIAamp PoweFecal
IX. Pembahasan
DNA merupakan materi genetik yang diturunkan. Molekul DNA tersimpan di
dalam nukleus sel dan sebagian kecil bisa ditemukan di mitokondria. DNA pada
inti sel disebut DNA inti, sedangkan DNA pada mitokondria disebut dengan
mtDNA. DNA inti merupakan perpaduan dari DNA ayah dan ibu. Analisis DNA
dimulai dengan melakukan ekstraksi DNA total dari sampel feses. Penelitian
metode ekstraksi merupakan bagian dari pemeriksaan pendahuluan mendapatkan
material DNA murni seperti Polymerase Chain Reaction. Semakin cepat putaran
centrifuge maka semakin cepat pula material seluler (sitoplasma, membran sel
yang terlarut) terpisah dimana materi DNA terfiltrasi dalam filtrat dan yang
lain masuk ke dalam tabung koleksi. Tahap ekstraksi DNA meliputi lisis sel,
presipitasi dan purifikasi. Konsentrasi hasil ekstraksi DNA dipengaruhi oleh 2
faktor yaitu kecepatan ekstraksi pada waktu ekstraksi dan komposisi penambahan
lysis buffer. Faktor kecepatan ekstraksi merupakan faktor paling berpengaruh
karena pada tahap lisis sel dan presipitasi pengambilan supernatan harus dilakukan
persampel, sehingga beberapa sampel terjadi pengendapan DNA (Komalasari.
2009).
Pada praktikum ekstraksi DNA ini menggunakan QIAamp PowerFecal DNA
Kit. Reagen dan komponen QIAamp PowerFecal DNA Kit dapat disimpan pada
suhu kamar (15-25 derajat C). QIAamp PowerFecal DNA Kit dirancang untuk
pemurnian (ekstraksi) DNA genom mikroba dan inangnya dengan mudah dan cepat
dari sampel feses dan feses. QIAamp PowerFecal DNA kit menggunakan Inhibitor
Removal Technology (IRT) yang sama untuk feses yang telah bekerja untuk tanah.
IRT sangat efektif untuk menghilangkan zat penghambat yang biasa ditemukan
dalam feses, seperti polisakarida, senyawa heme dan garam empedu. Hasilnya
adalah DNA yang sangat murni yang siap digunakan dalam ekstraksi DNA ini.
Ada beberapa tahapan dalam ekstraksi DNA sampel feses ini yaitu dari
persiapan sampel. Pada persiapan sampel menambahkan sampel ke tabung Dry
Bead, lalu ditambahkan larutan PoweBead dan Solution C1 lalu di vortex. Tahap
yang kedua ada melisiskan sel dengan menambahkan C2 lalu inkubasi pada suhu 2
derajat C - 8 derajat C. Selanjutnya tahapan yang ketiga IRT(Inhibitor Removal)
dengan menambahkan Solution C3 lalu diinkubasi kembali. Selanjutnya tahapan
yang ke empat mengikat DNA dengan menambahkan Solution C4 lalu muat ke
kolom putaran MB. Selanjutnya tahap ke lima mencuci DNA dengan Solution C5
dan yang terakhir elusi DNA dengan menambahkan Solution C6. Itulah prosedur
pokok dalam Kit DNA QIAamp PowerFecal.
Bila sudah menyelesaikan prosedur ekstraksi DNA dengan Kit DNA QIAamp
PowerFecal maka didapatkan ekstrak DNA murni yang selanjutnya digunakan
sebagai template pada proses amplifikasi dengan menggunakan PCR.
 LAPORAN PRAKTIKUM II
PCR
I. Materi Praktikum : Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA
II. Prinsip
PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus)
dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda. Untai
ganda DNA templat (unamplified DNA) dipisahkan dengan denaturasi termal dan
kemudian didinginkan hingga mencapai suatu suhu tertentu untuk memberi waktu
pada primer menempel (anneal primers) pada daerah tertentu dari target DNA.
Polimerase DNA digunakan untuk memperpanjang primer (extend primers) dengan
adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) dan buffer yang sesuai.
III. Metode
Metode yang digunakan yaitu menggunakan alat PCR dengan reagen pada KIT
yang sudah tersedia.
IV. Pendahuluan
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi
DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis pada
tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA
dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Komponen- komponen yang
diperlukan pada proses PCR adalah template DNA : sepasang primer, yaitu suatu
oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer
dengan urutan nukleotida DNA template : dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates);
buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA.
Proses PCR melibatkan beberapa tahap, yaitu :
a. Pra-denaturasi DNA Template
b. Denaturasi DNA Template
Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA
merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai
tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa
molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang
 tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA
untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR.
c. Penempelan Primer Pada Templat (Annealing)
Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang baik
adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 –
60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA
dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya tidak saling
berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya struktur
sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu
annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin
panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur
penempelan yang digunakan adalah antara 36℃ sampai dengan 72℃,
namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60℃.
d. Pemanjangan Primer (Extension)
Selama tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang
DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim
tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung
pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target.
e. Pemantapan (Post-Extension).
Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di
mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.
Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah :
a. DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan
yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105– 106 molekul. Dua hal
penting tentang cetakan adalah kemurnian dan kuantitas.
b. Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 –28
basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Dan
mempunyai kandungan G + C sebesar 50 – 60%.
c. Komponen pendukung lain adalah senyawa buffer. Larutan buffer PCR
umumnya mengandung 10 – Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), terdiri
dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat
 mengubah konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi
polimerisasi.
d. Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi
sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut
Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun
1969. Enzim polimerase taq tahan terhadap pemanasan berulang-ulang yang
akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan
wilayah yang mempunyai struktur sekunder.
e. 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau
BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak 0,01% atau dapat
diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu
ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah mesin
yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung
reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi.
V. Bahan dan Alat
a. Alat :
 Microtube
 Tabung PCR
 Vortex
 Spindown
 Biometra Tatnanmanced PCR
 Mikropipet
 Yellow tip
 Tissue
b. Bahan :
 Reagen PCR mix
 DNA template
 Primer forward
 Primer reverse
 Ca konsentrat
 Rolar loading
  H2O2
c. Sampel :
 Sampel Ekstraksi DNA
VI. Prosedur
a. Preparasi Sampel
1. Siapkan microtube untuk PCR mix.
2. Siapkan tabung PCR
3. Pastikan reagen yang akan dipakai mencair sempurna sebelum digunakan,
lalu vortex sebentar.
4. Masukan reagen PCR mix sebanyak 30 µl ke dalam mikro tube.
5. Masukan H2O2 sebanyak 10 µl ke dalam microtube melalui dinding tube.
6. Masukan coral sebanyak 2 µl ke dalam microtube melalui dinding tube.
7. Masukan primer sebanyak 2 µl ke dalam microtube melalui dinding tube.
8. Kemudian di spin down, lalu di vortex, dan di spin down kembali.
9. Ambil cairan dari tabung PCR mix sebanyak 23 µl dan pindahkan ke dalam
PCR tube.
10. Masukan ekstraksi DNA sebanyak 2 ultralite ke dalam PCR tube.
11. Homogenkan dengan cara Up and Down, kemudian homogenkan dengan
cara flick.
12. Kemudian di spin down.
b. Proses PCR
1. Memasukan sampel ke dalam alat PCR.
2. Pada alat kemudian tekan login, lalu tekan taeniasis, kemudian tekan
program overview.
3. Tekan three step, kemudian tekan open template.
4. Atur suhu 95℃ selama 3 menit untuk pre denaturasi.
5. Atur suhu 95℃ selama 30 detik untuk denaturasi.
6. Atur suhu 55℃ selama 30 detik untuk annealing.
7. Atur suhu 32℃ selama 1 menit untuk extension.
8. Atur suhu 72℃ selama 10 detik untuk final extension.
9. Atur suhu 4℃ selama waktu tak terhingga untuk elemetion.
10. Kemudian tunggu sampel running.
VII. Hasil dan Dokumentasi

Pada hasil PCR diperoleh molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru yang
merupakan hasil polimerisasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan
dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi
tergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Produk PCR dapat
diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.
VIII. Interpretasi Hasil
Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termo siklus. Sebuah mesin
yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung
reaksi dan mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting
dalam proses PCR yang selalu terulang dalam 30- 40 siklus dan berlangsung
dengan cepat :
1. Denaturasi Di dalam proses PCR, denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi DNA merupakan
proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya
berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA
terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap
mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi)
secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu
denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktivitas enzim Taq polymerase.
Aktivitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5
menit masing-masing pada suhu 92,5, 95 dan 97,5℃.
 2. Annealing (penempelan primer) Kriteria yang umum digunakan untuk
merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 – 25
basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya
sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer itu sendiri juga sebaiknya
tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan mengakibatkan terbentuknya
struktur sekunder pada primer tersebut dan mengurangi efisiensi PCR. Waktu
annealing yang biasa digunakan dalam PCR adalah 30 – 45 detik. Semakin
panjang ukuran primer, semakin tinggi temperaturnya. Kisaran temperatur
penempelan yang digunakan adalah antara 36oC sampai dengan 72℃, namun
suhu yang biasa dilakukan itu adalah antara 50 – 60℃.
3. Pemanjangan Primer (Extention) Selama tahap ini Taq polymerase memulai
aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan
nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72oC diperkirakan 35 – 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul
DNA target. Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang
basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini.
Biasanya di akhir siklus PCR waktu yang digunakan untuk tahap ini
diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan
terbentuk DNA untai ganda.
IX. Pembahasan
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan.
Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target
yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada
ujung 3' yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Proses PCR melibatkan
beberapa tahap, yaitu :
a) Pra-denaturasi DNA templat dengan suhu 95ºC - 3’
b) Denaturasi DNA templat
Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan
terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded). Temperatur
pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC merupakan
pilihan standar. Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan
 kandungan GC yang tinggi dari DNA template, tetapi half-life dari Taq
DNA Polymerase menekan secara tajam pada temperatur sekitar 95ºC.
c) Penempelan primer pada templat (annealing) dengan suhu 55ºC-30’
Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan
menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-
stranded DNA.
d) Pemanjangan primer (extension) dengan suhu 72ºC - 1’
Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru
DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa
nukleotida DNA target akan bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari
untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi
DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida
yang ditargetkan.
e) Final extension dengan suhu 72ºC - 10’
f) Elemetion dengan suhu 4oC selama waktu tak terhingga
Pada tahap 2 sampai dengan tahap 4 merupakan tahapan berulang
(siklus) yaitu sebanyak 25 kali yang dimana pada setiap siklus terjadi
duplikasi jumlah DNA. Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi
menggunakan Gel Electrophoresis.
 LAPORAN PRAKTIKUM III
PEMBUATAN AGAROSE
I. Materi Praktikum : Pembuatan Gel Agarose
II. Prinsip
Agarose gel elektroforesis adalah metode dari elektroforesis gel digunakan
dalam biokimia, biologi molekuler dan kimia klinik untuk pemisahan campuran
populasi DNA atau protein dalam matrik agarosa. Agarose gel elektroforesis
digunakan untuk analisis kualitas dari sampel DNA. Dengan menggunakan ukuran
marker yang tepat, itu digunakan untuk menaksir integritas DNA and menghitung
ukuran konsentrasi dari berbagai fragmen DNA. Penampakan pita DNA dari
elektroforesis ditentukan oleh persentase gel agarosa yang digunakan dalam
elektroforesis.
III. Metode
Pembuatan gel agarose dengan menggunakan serbuk agarose yang dicampur
dengan mendidihkan TAE
IV. Pendahuluan
Elektroforesis gel agarosa adalah metode elektroforesis gel yang digunakan
dalam biokimia, biologi molekuler, genetika, dan kimia klinis untuk memisahkan
populasi campuran makromolekul seperti DNA atau protein dalam matriks agarose,
salah satu dari dua komponen utama agar. Gel yang biasa digunakan adalah
agarosa. Gel agarosa adalah suatu polisakarida yang diekstraksi dari berbagai jenis
ganggang merah, atau poliakrilamid yang mampu melakukan separasi DNA dengan
kisaran ukuran yang luas. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel
DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb).
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang antara
100 bp-50 kb tergantung dari konsentrasi gel agarose yang digunakan, medan gerak
biasanya horizontal dan mempunyai laju pemisahan lebih cepat. Kebanyakan gel
agarosa yang digunakan antara 0,7-2% dilarutkan dalam buffer elektroforesis. COC
menggunakan 1% gel dengan alasan karena ukuran pori pemisahan yang bagus
untuk ukuran dari kira-kira 200 bp sampai 10 kb.
V. Alat dan Bahan
a. Alat :
  Gelas ukur
 Beaker glass
 Neraca analitik
 Erlenmeyer
 Kompor listrik
 Selop tangan tebal
 Tray
b. Bahan :
 Serbuk agarose
 TAE
 Aquadest
 Aluminium foil
VI. Prosedur
1. Karena konsentrasi agarose yang akan digunakan maka 0, 8%. agarose
ditimbang sebanyak 1,2 gr.
2. TAE yang diperlukan sebanyak 200 mL, pertama ukur TAE sebanyak 20 mL
lalu dilarutkan dengan aquades hingga mendapatkan TAE sebanyak 200 mL
dengan gelas ukur.
3. Masukkan serbuk agarose yang sudah ditimbang ke dalam erlenmeyer.
4. Ukur TAE yang sudah dilarutkan tadi dengan gelas ukur sebanyak 100 mL.
5. Masukkan TAE ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi serbuk agarose.
6. Homogenkan dan nyalakan kompor listrik
7. Letakkan erlenmeyer di atas kompor listrik supaya agarose cepat larut. Jangan
sampai mendidih.
8. Agarose dikatakan larut jika sudah bening seperti Kristal.
9. Masukkan dalam tray yang sudah disiapkan.
10. Setelah cairan gel agarose dituangkan, hindari terbentuknya gelembung. Buat
sumur dengan meletakkan sisir di bagian yang telah ditentukan.
11. Tunggu hingga berwarna putih susu.
VII. Hasil dan Dokumentasi

VIII. Interpretasi Hasil

Gel agarose yang baik setelah dipanaskan, semua serbuk gel berwarna putih
bening dan saat setelah didiamkan , memiliki tekstur seperti gel dan berwarna putih
susu. Jika gel agarose masih memiliki gumpalan atau belum terlarut
sempurna, menandakan gel agarose besempulum terlarut rna dan diperlukan
pemanasan kembali sampai berwarna bening. Tidak diperbolehkan adanya kotoran
baik dalam tabung ataupun dalam larutan yang digunakan, dikarenakan dapat
mempengaruhi hasil pembacaan dengan gel agarose ini. Saat penuangan cairan gel
agarose, jangan sampai membentuk gelembung udara agar kualitas gel agarose
yang terbentuk tetap baik.
IX. Pembahasan
Dalam pemeriksaan DNA menggunakan elektroforesis, tentunya diperlukan
media tempat DNA yang disebut gel agarose. Gel agarose ini dalam proses
pembuatannya harus steril dan terhindar dari adanya kontaminasi dengan
memastikan semua peralatan dan bahan yang digunakan steril. Dikarenakan gel
agarose ini mahal untuk didapatkan sehingga perlu adanya takaran khusus agar
pembuatanya sesuai dengan keperluan sehingga tidak menimbulkan efek saat
pembacaan DNA nanti menggunakan elektroforesis. Pembuatan gel agarose ini
sangat singkat, dimulai dari proses penimbangan serbuk agarose dan larutan TAE
yang akan digunakan untuk melarutkan, pemanasan gel diatas kompor listrik
sampai tidak terlihat lagi serbuk-serbuk gel atau sampai bening, setelah itu dicetak
pada alat elektroforesis dan tentukan sumur yang akan dibuat untuk peletakan
ekstraksi DNA.
Konsentrasi gel agarose sangat mempengaruhi laju migrasi DNA pada proses
elektroforesis. konsentrasi Agarosa yang digunakan akan menentukan besarnya
pori-pori gel yang akan memisahkan-misahkan DNA. Semakin rendah konsentrasi
agarose maka matriks gel akan semakin kecil dan fragmen DNA dapat dipisah
semakin jauh berdasarkan ukurannya. Gel Agarose digunakan untuk memisahkan
(separation), dan purifikasi DNA. Fragmen DNA bisa divisualisasikan setelah dicat
dengan dye (EtBr). Sampel DNA bisa dimasukkan (loading) dalam sumur (well)
gel yang kemudian bisa terpisah dengan menggunakan arus listrik. Ukuran DNA-
nya bisa berkisar antara 0.2 kb sampai 20 kb.
 LAPORAN PRAKTIKUM IV

ELEKTROFORESIS

I. Materi Praktikum : Elektroforesis Gel Agarosa

II. Prinsip
Sampel DNA ditempatkan dalam kotak gel sebelum diletakkan di sumur. Ujung
gel dengan sumur diposisikan ke arah elektroda negatif. Bagian ujung lainnya,
tanpa sumur (ke arah fragmen DNA bermigrasi) diarahkan ke elektroda positif.
Molekul bermuatan negatif, bergerak melalui gel saat arus listrik melewatinya yang
mana arus listrik dialirkan ke seluruh gel. Molekul bermigrasi menuju ,muatan
positif. Berikutnya, yang dimaksud migrasi, yaitu pergerakan molekul. Molekul
yang lebih kecil, bermigrasi lebih cepat serta bergerak lebih jauh dibandingkan
fragmen lebih besar. Karena itu, molekul dipisahkan berdasarkan ukuran.
Fragmen DNA bermigrasi melalui gel saat daya dihidupkan dan gel mengalir
kemudian fragmen dipisahkan berdasarkan ukurannya. Fragmen yang berukuran
besar berada di bagian atas gel (elektroda negatif, tempat dimulainya) sedangkan
fragmen terkecil berada di dekat bagian bawah (elektroda positif). Setelah fragmen
dipisahkan, gel dapat diperiksa dan dilihat ukuran pita yang ditemukan. Pita, yaitu
garis DNA yang terdefinisi dengan baik pada gel. Tiap pita, berisi sejumlah besar
fragmen DNA yang berukuran sama serta berjalan ke posisi yang sama.
Perbandingan pita dalam sampel dengan tangga DNA dapat diperkirakan
ukurannya. Penggunaan fluorescent dan pewarna memungkinkan DNA pada gel
dapat dilihat secara mudah setelah dipisahkan. Hal ini, akan muncul sebagai pita
pada gel.
III. Metode
Metode yang digunakan yaitu elektroforesis DNA dengan gel agarosa
IV. Pendahuluan
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat
diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk
protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan
pada analisis serta skala preparatif. Prinsip dasar teknik elektroforesis ini adalah
 bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini,
molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan.
Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, tetapi dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan
dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih
lanjut. Unit Elektroforesis merupakan alat yang digunakan dalam metode agarose
gel electrophoresis. Alat tersebut bekerja dengan mengalirkan tegangan selama
waktu tertentu agar DNA terpisah antara satu dengan lainnya sesuai dengan
muatannya. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA,
RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel
poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat
yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam
nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan
adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur
(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,
arah pergerakan adalah menuju elektrode positif, disebabkan oleh muatan negatif
alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju
perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
V. Bahan dan Alat
a. Bahan :
 Sampel ekstraksi DNA
  Gel Agarosa
 Larutan buffer TAE 1X
 Loading dye
 Kertas parafilm
 Larutan Etidium Bromide
 Marker
b. Alat :
 Alat Elektroforesis
 Mikropipet Dan Tipnya
 Beaker Glass
 UV Transluminato
VI. Prosedur
1. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis
yang telah diisi dengan larutan buffer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam
seluruhnya dalam TAE).
2. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.
3. Masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye ke dalam sumuran gel
agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu
secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
4. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang
dimasukkan.
5. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa
kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak
demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
6. Mengatur voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 80 V dan 30
menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
7. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run
pada sumber arus.
8. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis,.
keluarkan gel dan rendam dalam larutan ethidium 10 menit, kemudian air 5
menit. (PERINGATAN : Hati-hati EtBr bersifat karsinogenik)
 9. Letakkkan gel diatas UV transluminator, dan nyalakan UVnya. Amati pita-
pita DNA yang tervisualisasi dan ukurannya.
VII. Hasil dan Dokumentasi
Terdapat DNA pada hasil elektroforesis menggunakan gel agarosa, molekul
DNA dianalisis berdasarkan letaknya setelah mengalami migrasi pada proses
elektroforesis tersebut.

VIII. Interpretasi Hasil

Pada hasil elektroforesis gel agarosa yang diamati melalui UV transluminator,
terlihat potongan-potongan pita yang berisi sejumlah fragmen DNA. Perbandingan
migrasi fragmen-fragmen DNA tersebut menunjukkan ukuran DNA yang
disesuaikan dengan DNA marker yang terdapat pada gel agarose.
IX. Pembahasan
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan
secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada
berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang
menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein
bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga
di bawah pengaruh medan listrik.Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik
isoelektrik bersih dan massa molekul protein. Berdasarkan praktikum yang
dilakukan pada gel agarosa terdapat DNA pada hasil elektroforesis menggunakan
gel agarosa, molekul DNA dianalisis berdasarkan letaknya setelah mengalami
migrasi pada proses elektroforesis tersebut.
 LEMBAR PENGESAHAN

Laporan Praktikum Biologi Sel dan Molekuler

Dengan Judul

“Laporan Praktikum Mata Kuliah Biologi Sel dan Molekuler”

Oleh

NI PUTU ANANDA YULIASTRI DEWI

P07134220033

KELAS III A

Dosen Pembimbing Dosen Pembimbing

(Dr. drg. IGA. Ayu Putu Swastini, M.Biomed) (Heri Setiyo Bekti, S.ST., M.Biomed)

Dosen Pembimbing Instruktur/PLP

(Burhannddin, S.Si., M.Biomed) (Putu Ayu Suryaningsih, S.ST.)

Mahasiswa

(Ni Putu Ananda Yuliastri Dewi)