UJI SENSITIVITAS

MIKROBA
Oleh :
KELOMPOK 5
KELAS 2A PRODI SARJANA TERAPAN
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
DOSEN : IDA BAGUS OKA SUYASA, S.SI., M.SI
 ANGGOTA KELOMPOK 5
1. NI KADEK LIA HANDAYANI ( P07134220030)
2. NI KADEK ANGGI APRIANI (P071234422031)
3. NI PUTU KIREINA KARNITA (P07134220032)
4. NI PUTU ANANDA YULIASTRI DEWI (P07134220033)
5. NI PUTU ELSA KRISNA DEWI (P07134220034)
6. NI PUTU DIAH ANGGRENI (P07134220035)
7. NI MADE AYU OKTAPIANI A.D. (P07134220036)
 Uji Sensitivitas Antimikroba
Antimikroba
• Mekanisme kerja antimikroba antara lain menghambat sintesa dinding sel
bakteri, menghambat sintesis protein sel mikroba, menghambat metabolisme
sel mikroba, menghambat sintesa asam nukleat mikroba dan menganggu
keutuhan sel mikroba.
• Mekanisme terjadinya resistensi secara umum adalah jika antimikroba
mengalami inaktivasi, tidak dapat melewati barrier mikroba, efflux pump,
antimikroba tidak dapat mencapai tempat kerjanya atau dengan kata lain tidak
mencapai target dan terjadi mutasi.
• Antimikroba merupakan suatu substansi kimia yang dibentuk atau diperoleh
dari berbagai spesies mikroorganisme terutama jamur yang dalam konsentrasi
tertentu mampu menghambat pertumbuhan mikroorgannisme lain. Terdapat 3
prinsip dalam mengklasifikasikan antimikroba yaitu berdasarkan sifat
antimikroba (bakterisid dan bakteriostatik), berdasarkan target antimikroba dan
berdasarkan struktur kimia antimikroba.
 Berikut adalah mekanisme aktivasi dan resistensi
antimikroba yang akan di uji pada penelitian ini.
Amikacin
Merupakan bentuk semisintetik dari aminoglikosida. Antimikroba ini
bekerja dengan berikatan dengan ribosom 30S yang menyebabkan kesalahan
pembacaan mRNA sehingga menurunkan sintesa protein. Ikatan ini bersifat
reversibel sehingga menyebabkan bakteriostatik daripada bakterisid.

Mekanisme resistensi
• Resistensi muncul karena adanya bakteri yang menghasilkan
Aminoglycosida Modifying Enzyme yang dapat menginaktifkan antimikroba
dengan menambah gugus fosforil, adenil atau asetil pada antimikroba. Pada
bakteri Gram negatif enzim ini terdapat diluar membran sitoplasma.
Penambahan gugus fosforil, adenin atau asetil ini akan mengurangi transpor
antimikroba kedalam sel sehingga fungsi antimikroba akan terganggu.
Ampicillin sulbactam
• Merupakan derivat penisilin semisintetik dan penghambat beta laktamase.
Antimikroba ini sebagaimana antimikroba β laktamase lainnya bekerja
dengan menghambat sintesis dinding sel bakteri. Pada awalnya antimikroba
ini akan berikatan dengan reseptor PBP (penicillin binding protein) yang
dihasilkan oleh bakteri. Terdapat empat jenis PBP yang dihasilkan oleh
bakteri. PBP dengan berat molekul yang besar dan yang kecil akan
menghasilkan transpeptidase dan karboksipeptidase yang berperan dalam
sintesis dinding sel. Setelah perlekatan antimikroba beta laktam pada
PBP maka akan menganggu reaksi transpeptidase
• 2.1.2.1 Mekanisme resistensi.

lipopolisakarida dan peningkatan mekanisme efflux pump.

• 2.1.3. Ceftazidime
• Merupakan sefalosofrin generasi ketiga. Antimikroba ini potensial terhadap
bakteri batang Gram negatif terutama Pseudomonas aeruginosa. Aktifitas
antimikroba ini hampir sama dengan golongan beta laktamase lainnya dengan
cara menghambat sintesis dinding sel bakteri. 13,16
• Dinding bakteri Gram positif lebih banyak mengandung peptidoglikan dan asam
tekoat yang terdiri dari ribitol fosfat atau gliserol fosfat, sedangkan Gram
negatif mengandung lipopolisakarida dan sedikit peptidoglikan. Peptidoglikan
merupakan polisakarida yang terdiri dari N-acetylglucosamine (NAG) dan N-
acetylmuramic acid. Rantai polisakarida ini akan membentuk cross link pada sisi
pentapeptida dari N-acetylmuramic acid membentuk struktur seperti jaring
dengan bantuan enzim transpeptidase, karboksipeptidase dan endopeptidase.
Struktur ini yang memyebabkan kekakuan dinding sel. 13,16
• Cincin beta laktamase pada penisilin dan sefalosorin mempunyai bentuk yang
serupa dengan terminal D- alanin dari pentapeptide. Antimikroba ini akan
berikatan secara kovalen dengan enzim terutama transpeptidase sehingga
aktifitas enzim ini berkurang.
 Uji Kepekaan Antimikroba
• Uji kepekaan terhadap antimikroba berawal pada pertemuan yang
diprakarsai WHO di Geneva (1977), hal ini disebabkan semakin
luasnya resistensi antimikroba baik yang berhubungan dengan
infeksi manusia atau hewan. Masalah ini akhirnya mencetuskan
suatu program surveilance untuk memonitor resistensi antimikroba
yaitu uji kepekaan dengan menggunakan metode yang sesuai.21
• Adanya tes kepekaan terhadap antimikroba akan membantu dokter
klinik untuk menentukan antimikroba yang sesuai untuk mengobati
infeksi. Agar mendapatkan hasil yang tepat maka tes kepekaan
harus dilakukan dengan metode yang akurat dan presisi yang baik
dimana metode tersebut langsung dapat digunakan dalam
menunjang upaya pengobatan.
• Tujuanpembakuan uji kepekaan antimikroba adalah :
untuk memberikan suasana pertumbuhan kuman yang
optimal sehingga hambatan pertumbuhan kuman
disebabkan oleh antimikroba dan bukan karena faktor
lain, menjaga integritas dan aktivitas antimikroba
sehingga pada saat terjadi resistensi, dipastikan
penyebabnya adalah mikroba tersebut bukan karena
inaktivasi obat dan menjaga konsistensi hasil
pemeriksaan dimana diharapkan kuman yang sama
akan menghasilkan pola kepekaan yang sama pula.
 Metode uji kepekaan antimikroba
Metode yang digunakan dalam uji kepekaan
antimikroba antara lain metode difusi cakram dan
metode berdasarkan penetapan MIC yang terdiri
metode makro dilusi, metode mikro dilusi (dapat
dilakukan secara otomatis) dan metode difusi
gradient.
 1. Metode difusi cakram
Metode difusi cakram merupakan metode yang sederhana,
praktis dan sudah distandarisasi oleh CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute). Metode ini paling banyak digunakan di
laboratorium mikrobiologi. Pemeriksaan ini dilakukan dengan
mengaplikasikan suspensi kuman ke permukaan agar Mueller-
Hinton (MH) kemudian diletakkan cakram kertas yang
mengandung antimikroba dengan kadar tertentu kemudian
diinkubasi selama 1 hari pada suhu 35˚C kemudian dilakukan
pengukuran zona hambatan disekitar pertumbuhan kuman.
Sensitivitas metode ini dilaporkan 79%-97% dengan spesifitas
94%-100%. Hasil disajikan secara kualitatif berdasarkan kategori
sensitif, intermediate dan resisten
 2. Metode dilusi cair
Metode dilusi cair yang pertama adalah makro dilusi. Prinsip
pemeriksaan ini adalah dengan pengenceran antimikroba. Keuntungan
dari metode ini adalah didapatkan hasil MIC secara kuantitatif namun
metode ini memerlukan ketrampilan manual yang baik, kemungkinan
kesalahan cukup tinggi, bahan yang banyak sehingga biaya menjadi
tinggi dan memerlukan tempat yang luas untuk pemeriksaan. Karena
keterbatasan metode diatas maka dikembangkan metode mikro dilusi.
Metode ini mengunakan alat disposable yang sudah distandarisasi.
Keuntungannya selain menentukan MIC secara kuantitatif, lebih
mudah dalam persiapan sampel, hemat bahan dan tempat, selain itu
juga dapat dilaporkan secara komputerisasi. Kerugiannya tidak
fleksibel dalam pemilihan antimikroba yang tersedia pada panel
komersial standar.
3. Metode dilusi mikro dengan cara
otomatisasi
Terdapat empat instrumen otomatisasi yang diakui
oleh FDA (Food and Drug administrasion) dan
dipergunakan di laboratorium di Amerika serikat yaitu
Vitex legacy system, Vitex 2 system (Biomerieux, Inc
Hazelwood Mo), MicroScan walkaway System (Dade
international, sacramento California) dan Pheonox system
(BD Microbiology system, Coksville,Md). Ke empat
sistem ini berbeda dalam cara pengerjaannya, namun
secara umum pemeriksaan ini dengan menggunakan
fotometri.
 4. Metode difusi gradien mikroba
Prinsip pemeriksaan adalah penetapan gradien kadar
antimikroba dalam media agar untuk menentukan kepekaan.
Bahan untuk pemeriksaan metode ini adalah dalam bentuk strip
yang sudah dilekatkan antimikroba dengan kadar tertentu. Dalam
plat agar yang sudah diinokulasi kuman dilekatkan 5-6 strip
antimikroba yang diletakkan secara radial. setelah diinkubasi
dalam satu malam, tes dibaca dengan melihat zona hambatan
yang berbentuk elips. MIC ditentukan pada titik potong terendah
zona hambatan bagian strip dengan kertas strip.
Sensitivitas dan spesifitas metode ini adalah 87%-100%. Secara
umum hasil uji kepekaan metode ini berkorelasi baik dengan
metode dilusi cair atau dilusi agar.
 Nilai breakpoint akan berbeda pada antimikroba yang
berbeda. Dasar penentuan breakpoint diperoleh melalui analisa
distribusi MIC, sifat farmakodinamik dan farmakokinetik
antimikroba dan data klinis yang menghubungkan antara MIC
dengan outcome pasien. Berikut adalah tabel penentuan
breakpoint yang ditetapkan oleh CLSI tahun 2012.
Penetapan breakpoint antara metode difusi cakram dengan
MIC yang paling dipercaya adalah membuat korelasi diameter
zona hambatan dengan MIC. Cara sederhana adalah dengan
membuat plot scattergram ukuran zona hambatan dalam
milimeter terhadap MIC, kemudian dilakukan analisis unutk
menentukan kriteria breakpoint.
 Breakpoint
Breakpoint merupakan titik atau angka yang sudah disepakati
oleh CLSI dan EUCAST (European Union Comitte on
Antimicrobial Susceptibility Testing) dalam membuat interpretasi
hasil uji kepekaan difusi cakram dan MIC, apakah isolat tersebut
sensitif, intermediate atau resisten.
Sensitif jika isolat pertumbuhannya dihambat oleh
antimikroba pada kadar yang biasa dicapai bila digunakan pada
dosis normal pada lokasi infeksi, intermediate jika memerlukan
dosis yang lebih tinggi dari dosis normal untuk menghambat
pertumbuhan antimikroba dan resisten jika pertumbuhan kuman
tidak dapat dihambat dengan pemberian antimikroba dengan
dosis normal.
 Hasil pemeriksaan kemudian diplot pada diagram, kemudian
jumlah outlier dihitung dan dibuat persentase. Persentase ini
menunjukan ketidaksesuaian interpretasi antara difusi cakram
dan MIC yang disebut ''interpretative error''. Pemeriksaan ini
sangat penting karena jika melebihi batas persentase yang
ditetapkan maka pemeriksaan ini harus ditelaah kembali karena
berhubungan dengan pemberian antibiotik kepada pasien.
METODOLOGI
PEMERIKSAAN
Alat yang Diperlukan dalam
Pemeriksaan Antimikroba

• Cawan petri diameter 9 cm

• Agar McConkey
• Agar Mueller-Hinton (MH) dari Oxoid Ltd.
• Lemari pendingin
• Inkubator
• Standar McFarland 0,5
• Lampu bunsen
• Ose
• Lidi kapas steril
Reagen dan Kuman Kontrol
• Cakram antimikroba dari Oxoid Ltd terdiri dari
cakram AK, cakram AMS, cakram CAS, cakram
CS dan cakram DOR.
• MIC strip tes dari Liofilchem yaitu strip AK 0.016
– 256 µg/mL, strip AMS 0.016-256 µg/mL, strip
CAS 0.016-256 µg/mL, strip CS 0.016 – 256
µg/mL dan strip DOR 0.002-32 µg/mL.
• Kuman kontrol E.coli ATCC 25922 dan
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Prosedur Pemeriksaan
• Persiapan Agar Mueller Hinton
Agar MH dipersiapkan dari dehydrated base sesuai
rekomendasi pabrik. Media ini harus dapat menjadi
kontrol terhadap ukuran zona inhibisi bakteri kontrol
sesuai batas yang diketahui, media tidak boleh dipanaskan
berlebihan. . Sterilkan media pada suhu 121˚C selama 15
menit kemudian dinginkan pada suhu 45-50˚C dan
dituangkan kedalam plat dengan ketebalan 4 mm. Setelah
agar memadat, jika akan segera digunakan plat
dikeringkan pada suhu 35˚C selama 10 – 30 menit dengan
cara diletakkan dalam inkubator dengan tutup terbuka
Prosedur Pemeriksaan
• Disk (Cakram).
Cakram antimikroba harus disimpan pada suhu -20˚C.
Cakram ini dapat disimpan di lemari es dalam waktu 1 bulan.
Bila akan digunakan keluarkan cakram dari lemari es kemudian
dibiarkan pada suhu ruangan selama 1 jam sebelum digunakan.
• MIC strip test (Liofilchem)
MIC strip test harus disimpan pada suhu -20˚C jika
tidak digunakan. Strip yang sudah dibuka dapat disimpan
pada suhu 2-8˚C dan jika ingin digunakan keluarkan dari
lemari pendingan dan biarkan pada suhu ruangan selama 1
jam.
Prosedur Pemeriksaan
• Pemantauan Mutu Internal
Sebelum dilakukan pemeriksaan terhadap sampel
maka dilakukan pemantapan mutu pemeriksaan uji
kepekaan dengan Etest AK, AMS, CAZ, CS, DOR dan
metode difusi cakram dengan bakteri kontrol E.coli ATCC
25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 sebagai
kontrol positif. Pemantapan mutu dapat diterima bila
memberikan hasil positif sesuai dengan kuman kontrol.32
Prosedur Kerja
• Pemeriksaan Uji Kepekaan
Cawan petri agar MH yang sudah lolos kontrol mutu dibiarkan
pada suhu kamar. Puncak koloni biakan murni pada agar Mac Conkey
diambil dengan sengkelit steril (3-5 koloni) kemudian dipindahkan
kedalam tabung berisi larutan salin. Kekeruhan diatur agar sesuai
dengan kekeruhan standar 0.5 McFarland, apabila kekeruhan kurang
dari standar ditambahkan koloni bakteri, bila lebih keruh
ditambahkan larutan salin.
Cawan petri kemudian diinkubasi pada suhu 35˚C selama 16-18
jam. Setelah diinkubasi silakukan pengukuran diameter zona tiap
cakram dengan penggaris melalui bagian bawah cawan petri tanpa
membukanya. Hasil pengukuran dilaporkan dalam milimeter dan
lakukan interpretasi.
Prosedur Kerja
• Pemeriksaan dengan MIC Strip
Strip MIC diletakkan pada permukaan agar MH yang
telah diinokulasi kuman dengan mengunakan pinset steril
dengan posisi skala menghadap ke atas, kemudian tekan
dengan perlahan untuk memastikan strip antimikroba
kontak dengan permukaan agar MH, cawan dibiarkan 15
menit agar strip melekat pada MH. Antimikroba yang
telah dilekatkan dengan kadar gradien eksponen pada
strip akan tersebar ke matriks agar. Setelah inkubasi
kurang lebih 18-24 jam ada suhu 35˚C akan terlihat area
hambatan berbentuk elips disepanjang strip.
TERIMA KASIH