Dalam beberapa tahun terakhir, ada minat yang semakin besar dalam meneliti dan mengembangkan

antimikroba baru

agen dari berbagai sumber untuk memerangi resistensi mikroba. Karena itu, perhatian yang lebih besar
telah dibayarkan

untuk penyaringan aktivitas antimikroba dan metode evaluasi. Beberapa bioassay seperti difusi-cakram,
yah

difusi dan kaldu atau pengenceran agar dikenal dan umum digunakan, tetapi yang lain seperti aliran cyto
florometrics

dan metode bioluminescent tidak banyak digunakan karena mereka membutuhkan peralatan khusus

dan evaluasi lebih lanjut untuk reproduktifitas dan standardisasi, bahkan jika mereka dapat memberikan
hasil yang cepat

efek agen antimikroba dan pemahaman yang lebih baik tentang dampaknya terhadap kelangsungan
hidup dan

Kerusakan sel dipengaruhi oleh mikroorganisme yang diuji. Dalam artikel ulasan ini, daftar lengkap in
vitro

metode pengujian kerentanan antimikroba dan informasi terperinci tentang kelebihan dan
keterbatasannya

dilaporkan.

ulasan ini, berfokus pada penggunaan metode tes antimikroba

untuk penyelidikan in vitro dari ekstrak alami dan obat murni sebagai agen antimikroba potensial.

Setelah revolusi di "era emas", ketika hampir semua kelompok

antibiotik penting (tetrasiklin, sefalosporin, aminoglikosida

dan makrolida) ditemukan dan masalah utama dari

kemoterapi diselesaikan pada 1960-an, sejarah berulang

kembali saat ini dan senyawa yang menarik ini dalam bahaya

kehilangan kemanjurannya karena peningkatan resistensi mikroba

[1]. Saat ini, dampaknya cukup besar dengan kegagalan pengobatan

terkait dengan bakteri yang resistan terhadap beberapa obat dan telah menjadi

kepedulian global terhadap kesehatan masyarakat [2,3].

Untuk alasan ini, penemuan antibiotik baru adalah

tujuan penting. Produk alami masih merupakan salah satu sumber utama

molekul obat baru hari ini yang berasal dari

bakteri prokariotik, mikroorganisme eukariotik, tanaman dan

berbagai organisme hewan. Mikroba dan produk tanaman menempati

bagian utama dari senyawa antimikroba yang ditemukan sampai

sekarang [4].

Tumbuhan dan sumber alami lainnya dapat menyediakan sejumlah besar

senyawa yang kompleks dan beragam secara struktural. Baru-baru ini, banyak peneliti

telah ber fokus pada investigasi tanaman dan ekstrak mikroba

, minyak esensial, metabolit sekunder murni dan disintesis

molekul baru sebagai agen antimikroba potensial [5-7].

Berbagai metode laboratorium dapat digunakan untuk mengevaluasi atau

Menskrining aktivitas antimikroba secara in vitro dari ekstrak atau murni

senyawa. Metode dasar yang paling dikenal adalah difusi-cakram

dan metode kaldu atau agar-agar. Metode lainnya adalah

digunakan terutama untuk pengujian antijamur, seperti teknik makanan beracun

. Untuk mempelajari lebih lanjut efek antimikroba dari suatu agen di

Direkomendasikan untuk menguji kedalaman, waktu-matikan dan metode cyto florometrik,

yang memberikan informasi tentang efek sifat penghambatan

(bakterisida atau bakteriostatik) (tergantung waktu atau

tergantung konsentrasi) dan kerusakan sel yang mempengaruhi uji

mikroorganisme.

Karena daya tarik baru dengan sifat produk antimikroba baru

seperti memerangi bakteri yang resistan terhadap beberapa obat, hal itu

Penting untuk mengembangkan pemahaman yang lebih baik tentang arus

metode yang tersedia untuk skrining dan / atau mengukur antimikroba

efek dari ekstrak atau senyawa murni untuk aplikasinya

dalam kesehatan manusia, pertanian dan lingkungan. Karenanya, dalam

Ulasan ini, teknik untuk mengevaluasi antimikroba in vitro

kegiatan dibahas secara rinci.

2. Metode difusi

2.1. Agar-difusi metode disk

Pengujian difusi agar disk adalah metode yang dikembangkan pada tahun 1940

Dan resmi digunakan di banyak laboratorium mikrobiologi klinis untuk

uji kepekaan antimikroba secara rutin. Saat ini, banyak diterima

dan disetujui sebagai standar yang diterbitkan oleh Klinik dan Laboratorium

Lembaga Standar (CLSI) untuk pengujian bakteri dan ragi

[]. Meskipun tidak semua bakteri dapat diuji secara akurat

dengan metode ini, standardisasi telah dibuat untuk menguji

patogen bakteri nakal seperti streptokokus,

Haemophilus in fluenzae,

Haemophilus parain fluenzae, Neisseria gonorrhoeae dan

Neisseria meningitidis, menggunakan media kultur spesifik, berbagai kondisi inkubasi

dan kriteria interpretatif untuk zona hambatan

[9].

Dalam prosedur ini agar piring diinokulasi dengan

standar inokulum dari mikroorganisme uji. Lalu, saring

cakram kertas dengan diameter sekitar 6 mm, mengandung senyawa uji

pada konsentrasi yang diinginkan, ditempatkan pada permukaan agar.

Cawan Petri diinkubasi dalam kondisi yang sesuai. Umumnya,

agen antimikroba berdifusi ke dalam agar dan menghambat perkecambahan

dan pertumbuhan mikroorganisme uji dan kemudian

diameter zona pertumbuhan penghambatan diukur (Gbr. 1A). tabel

1 menunjukkan media pertumbuhan, suhu, periode inkubasi

dan ukuran inokulum yang dibutuhkan oleh standar CLSI.

Antibiogram memberikan hasil kualitatif dengan mengkategorikan bakteri

sebagai rentan, menengah atau resisten [11]. Karena itu, ini adalah

alat mengetik berdasarkan fenotip resistensi mikroba

Ketegangan diuji, hasilnya juga memandu dokter dalam yang sesuai

pemilihan perawatan empiris awal, dan antibiotik yang digunakan untuk

pasien individu dalam situasi tertentu [12]. Namun

penghambatan pertumbuhan bakteri tidak berarti kematian bakteri,

metode ini tidak dapat membedakan efek bakterisida dan bakteriostatik.

Selain itu, metode difusi agar disk tidak sesuai

Untuk menentukan konsentrasi hambat minimum (MIC), sebagaimana adanya

mustahil untuk mengukur jumlah agen antimikroba

menyebar ke dalam media agar. Namun demikian, perkiraan MIC

dapat dihitung untuk beberapa mikroorganisme dan antibiotik oleh

membandingkan zona hambatan dengan algoritma yang tersimpan [13].

Namun demikian, uji difusi cakram menawarkan banyak keunggulan

metode lain: kesederhanaan, biaya rendah, kemampuan luar biasa untuk menguji

jumlah mikroorganisme dan agen antimikroba, dan

kemudahan menafsirkan hasil yang diberikan. Apalagi beberapa penelitian sudah

menunjukkan minat besar pada pasien yang menderita bakteri

infeksi antibiotik yang didasarkan pada antibiogram dari

agen penyebab [14]. Fakta ini disebabkan oleh korelasi yang baik

antara data in vitro dan evolusi in vivo [12].

Sebelum standarisasi, metode difusi disk sudah dilakukan yang

digunakan untuk menguji posaconazole terhadap jamur berfilamen [15],

micafungin melawan Aspergillus [16], dan caspofungin melawan Aspergillus

dan Fusarium [17]. Saat ini, antijamur standar

pendekatan disk-difusi digunakan untuk menguji filamen non-dermatofit

jamur [18]. Media kultur, ukuran inokulum dan inkubasi

kondisi disebutkan dalam Tabel 1 [19].

Keuntungan metode ini yang disebutkan di atas, terutama

Kesederhanaan dan biaya rendah, telah berkontribusi pada penggunaan umum untuk

skrining antimikroba dari ekstrak tumbuhan, minyak atsiri dan

obat-obatan lainnya [20-23].

2.2. Metode gradien antimikroba (Etest)

Metode gradien antimikroba menggabungkan prinsip

metode pengenceran dengan metode difusi untuk menentukan

nilai MIC. Hal ini didasarkan pada kemungkinan menciptakan

gradien konsentrasi agen antimikroba yang diuji dalam

media agar. The Etest

(BioMérieux) adalah versi komersial dari

teknik ini. Dalam prosedur, strip diresapi dengan in-

peningkatan gradien konsentrasi agen antimikroba dari

satu ujung ke ujung lainnya diendapkan pada permukaan agar, sebelumnya

diinokulasi dengan mikroorganisme yang diuji.

Metode ini digunakan untuk penentuan antibiotik MIC,

antijamur dan antimikobakteri [24]. Nilai MIC ditentukan

di persimpangan strip dan elips hambatan pertumbuhan. Saya t

sederhana untuk diterapkan; oleh karena itu, secara rutin digunakan untuk memenuhi

mands dari dokter. Namun, Etest

strip harganya sekitar $ 2–3 masing-masing.

Oleh karena itu, pendekatan ini menjadi mahal jika banyak obat

diuji [11].

Beberapa penelitian sebelumnya telah menunjukkan korelasi yang baik antara

nilai MIC ditentukan oleh Etest dan yang diperoleh oleh

pengenceran kaldu atau metode pengenceran agar [25-27]. Teknik ini bisa

juga dilakukan untuk menyelidiki interaksi antimikroba

antara dua obat [28]. Untuk mempelajari efek gabungan dari dua
antibiotik, strip Etest, diresapi dengan antibiotik pertama, adalah

ditempatkan pada permukaan pelat agar yang diinokulasi sebelumnya. Setelah satu jam, itu

strip dihapus dan diganti dengan yang lain diresapi dengan a

antibiotik kedua. Sinergi terdeteksi oleh penurunan MIC

kombinasi dengan setidaknya dua pengenceran dibandingkan dengan dari

antibiotik yang paling aktif diuji sendiri [29]. Juga untuk hal yang sama

tujuan, strip Etest dapat diendapkan pada media agar dalam a

formasi silang dengan sudut 90 ° di persimpangan antara

sisik pada masing-masing MIC untuk mikroorganisme yang diuji [30].

Kemudian, setelah inkubasi, konsentrasi penghambatan fraksional

dex (FICI) dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

= () + () FICI FIC A FIC B

dimana FIC A

() =

()

()

MIC A dalam kombinasi

MIC A sendiri

dan

() =

FIC B

()

()

MIC B dalam kombinasi

MIC B sendiri

Synergy didefinisikan oleh FICI r0.5 dan antagonisme oleh FICI 44.

FICI antara 0,5 dan 1 ditafsirkan sebagai tambahan dan antara

1 dan 4 sebagai ketidakpedulian [31].

2.3. Metode difusi lainnya

Metode difusi lebih lanjut digunakan dalam penelitian mikrobiologi

laboratorium untuk menyaring ekstrak, fraksi atau zat murni

untuk potensi antimikroba mereka atau untuk menyelidiki antagonisme

antara mikroorganisme. Di antara metode ini, yang paling umum

tercantum di bawah ini.

2.3.1. Agar metode difusi dengan baik

Metode difusi agar sumur banyak digunakan untuk mengevaluasi

aktivitas timicrobial dari tanaman atau ekstrak mikroba [32,33]. Demikian pula

untuk prosedur yang digunakan dalam metode difusi cakram, pelat agar

permukaan diinokulasi dengan menyebarkan volume inokulum mikroba

di atas seluruh permukaan agar. Lalu, sebuah lubang dengan diameter

dari 6 sampai 8 mm ditinju secara aseptik dengan penggerek gabus steril atau

ujung, dan volume (20-100 mL) agen antimikroba atau ekstrak

solusi pada konsentrasi yang diinginkan dimasukkan ke dalam sumur. Kemudian,

Pelat agar diinkubasi dalam kondisi yang sesuai tergantung

pada uji mikroorganisme. Agen antimikroba berdifusi dalam

media agar dan menghambat pertumbuhan strain mikroba

diuji (Gbr. 1B).

2.3.2. Metode difusi agar steker

Metode difusi agar steker sering digunakan untuk menyoroti

tagonisme antara mikroorganisme [34,35], dan prosedurnya adalah

mirip dengan yang digunakan dalam metode difusi disk. Itu melibatkan

membuat kultur agar-agar dari strain yang diinginkan

media kultur dengan garis-garis ketat di permukaan piring. Selama mereka

pertumbuhan, sel mikroba mengeluarkan molekul yang berdifusi dalam agar

medium. Setelah inkubasi, plot-agar atau silinder dipotong secara aseptik

dengan penggerek gabus steril dan diendapkan pada permukaan agar

piring lain yang sebelumnya diinokulasi oleh mikroorganisme uji.

Zat-zat tersebut berdifusi dari colokan ke media agar. Kemudian,

aktivitas antimikroba dari molekul disekresikan mikroba adalah

terdeteksi oleh munculnya zona hambatan di sekitar agar-agar

colokan (Gbr. 1C).

2.3.3. Metode lintas garis

Metode cross streak digunakan untuk menyaring mikroorganisme dengan cepat

untuk antagonisme [36]. Strain mikroba yang diminati diunggulkan oleh a

goresan tunggal di tengah piring agar-agar. Setelah inkubasi

periode tergantung pada strain mikroba, piring diunggulkan

dengan mikroorganisme diuji dengan streak tunggal tegak lurus terhadap

garis tengah. Setelah inkubasi lebih lanjut, interaksi antimikroba

dianalisis dengan mengamati ukuran zona hambat.

2.3.4. Metode makanan beracun

Metode makanan beracun sebagian besar digunakan untuk mengevaluasi antijamur

efek terhadap cetakan [37-39]. Agen antijamur atau ekstraknya adalah

dimasukkan ke dalam agar cair pada konsentrasi akhir yang diinginkan

dan tercampur rata. Kemudian, medium dituangkan ke dalam cawan Petri.

Setelah pra-inkubasi semalam, inokulasi dapat dilakukan dengan a

disc mycelia mulai dari 2 sampai 5 mm, yang disimpan di

tengah piring. Setelah inkubasi lebih lanjut dalam kondisi yang sesuai

untuk strain jamur yang diuji, diameter pertumbuhan jamur

di piring kontrol dan sampel diukur, dan antijamur

Efek diperkirakan dengan rumus berikut:

() = ((-)) × Aktivitas antijamur% Dc Ds / Dc 100

Di mana Dc adalah diameter pertumbuhan di pelat kontrol dan Ds adalah

diameter pertumbuhan di piring yang mengandung antijamur diuji

agen. Sporulasi juga dapat dibandingkan dengan kontrol.

Secara umum, ketika standardisasi metode yang digunakan gagal,

Peneliti harus membawa kontrol positif dengan antimikroba yang dikenal

molekul untuk membandingkan hasil yang ditemukan dan menyatakan

pendekatan eksperimental yang tepat.

3. Kromatografi lapis tipis (KLT) –bioautografi

Pada tahun 1946, Goodall dan Levi [40] menggabungkan kromatografi kertas

metode (PC) dengan kontak bioautografi untuk mendeteksi yang berbeda

penisilin untuk tekad mereka. Setelah itu, Fischer dan Lautner

[41] memperkenalkan TLC di bidang yang sama. Teknik ini menggabungkan TLC

dengan metode deteksi biologis dan kimia. Beberapa

pekerjaan telah dilakukan pada penyaringan ekstrak organik, terutama

ekstrak tumbuhan, untuk aktivitas antibakteri dan antijamur oleh TLC-

bioautografi [42,43]. Seperti yang ditunjukkan di bawah ini, tiga bioautografis

teknik, yaitu difusi agar, bioautografi langsung, dan agaroverlay

uji, telah dijelaskan untuk penyelidikan antimikroba

senyawa dengan pendekatan ini.

3.1. Agar difusi

Juga dikenal sebagai metode kontak agar, ini adalah metode yang paling sedikit digunakan

salah satu tekniknya. Ini melibatkan transfer dengan difusi

agen antimikroba dari kromatogram (PC atau TLC) ke agar

piring sebelumnya diinokulasi dengan mikroorganisme yang diuji. Setelah

beberapa menit atau jam untuk memungkinkan difusi, kromatogramnya adalah

dihapus dan piring agar diinkubasi. Hambatan pertumbuhan

zona muncul di tempat-tempat, di mana senyawa antimikroba

kontak dengan lapisan agar [44].

3.2. Bioautografi langsung

Bioautografi langsung adalah metode yang paling banyak diterapkan di antaranya

tiga metode. Plat TLC yang dikembangkan dicelupkan ke dalam atau disemprotkan

dengan suspensi mikroba. Kemudian, bioautogram diinkubasi di

25 ° C selama 48 jam dalam kondisi lembab [45]. Untuk visualisasi

tumbuh mikroba

garam tetrazolium sering digunakan. Garam ini

menjalani konversi ke formazan berwarna intens yang sesuai

oleh dehydrogenases sel hidup [46,47]. p-Iodonitrotetrazolium

violet adalah reagen deteksi yang paling cocok

[44,48]. Garam ini disemprotkan ke bioautogram, yaitu

direinkubasi pada 25 ° C selama 24 jam [49] atau pada 37 ° C selama 3-4 jam [5]. Itu

Kaldu Mueller Hinton yang dilengkapi dengan agar telah direkomendasikan

untuk memberikan cairan yang cukup untuk memungkinkan kepatuhan yang terbaik

ke pelat TLC dan menjaga kelembaban yang sesuai untuk

pertumbuhan bakteri [50].

Bioautografi langsung dapat digunakan dengan jamur atau

bakteri. Ini adalah teknik termudah untuk mendeteksi antijamur

zat, dan juga memberikan hasil yang konsisten untuk memproduksi spora

jamur seperti Aspergillus, Penicillium dan Cladosporium [51,52] .For

bakteri, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

strain sering digunakan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri

[42]

, 53].

3.3. Agar overlay bioassay

Juga dikenal sebagai bioautografi imersi, itu adalah hibrida dari

kedua metode sebelumnya. Piring TLC ditutup dengan biji yang dicairkan

media agar. Untuk memungkinkan difusi yang baik dari yang diuji

senyawa ke dalam media agar, piring dapat ditempatkan pada rendah

suhu selama beberapa jam sebelum inkubasi. Setelah inkubasi

dalam kondisi yang sesuai tergantung pada mikroorganisme uji,

pewarnaan dapat dibuat dengan pewarna tetrazolium. Seperti bioautografi langsung,

metode ini dapat diterapkan untuk semua mikroorganisme seperti

Candida albicans [54] dan cetakan [43]. Ini memberikan definisi yang baik

zona hambatan pertumbuhan dan tidak sensitif terhadap kontaminasi [44].

Secara keseluruhan, TLC-bioautografi sederhana, efektif dan murah

teknik untuk pemisahan campuran kompleks, dan

pada saat yang sama, ini melokalisasi konstituen aktif pada TLC

piring. Karena itu, dapat dilakukan keduanya di laboratorium yang canggih

dan laboratorium kecil yang hanya memiliki akses ke a

minimum peralatan [44]. Meski memiliki online canggih

kromatografi cair kinerja tinggi digabungkan bioassay,

yang menjadi semakin populer sebagai metode pilihan

untuk pembersihan akhir dari fraksi ekstraktif untuk mendapatkan senyawa murni,

TLC - bioautografi menawarkan teknik cepat untuk

penyaringan sejumlah besar sampel untuk bioaktivitas dan dalam

fraksionasi terbimbing bioaktif [45]. Dapat digunakan untuk deteksi

antimikroba dalam sampel lingkungan dan makanan serta untuk

mencari obat antimikroba baru.

4. Metode pengenceran

Metode pengenceran adalah yang paling tepat untuk penentuan

nilai MIC, karena mereka menawarkan kemungkinan untuk memperkirakan

konsentrasi zat antimikroba yang diuji dalam

agar (agar pengenceran) atau media kaldu (macrodilution atau microdilution).

Baik metode kaldu atau pengenceran agar dapat digunakan untuk itu

secara kuantitatif mengukur aktivitas antimikroba in vitro terhadap

bakteri dan jamur. Nilai MIC yang direkam didefinisikan sebagai yang terendah

konsentrasi zat antimikroba yang diuji yang menghambat

pertumbuhan yang terlihat dari mikroorganisme yang diuji, dan biasanya dinyatakan

dalam mg / mL atau mg / L. Ada banyak pedoman yang disetujui untuk

pengenceran uji kepekaan antimikroba yang rewel atau tidak cepat saji

bakteri, ragi dan jamur berfilamen. Yang paling dikenal

standar disediakan oleh CLSI dan Eropa

Komite Pengujian Kerentanan Antimikroba (EUCAST). Sebagai

disarankan, pedoman ini memberikan prosedur yang seragam untuk pengujian

yang praktis dilakukan di sebagian besar laboratorium mikrobiologi klinis.

Pengembangan standar metodologi seperti itu tidak

menjamin relevansi klinis dari pengujian tersebut. Namun demikian, itu

memang memungkinkan bioassay dilakukan dalam pendekatan standar

untuk mengevaluasi relevansi klinis hasil [55].

4.1. Metode pengenceran kaldu

Kaldu mikro atau pengenceran makro adalah salah satu antimikroba paling dasar

metode pengujian kerentanan. Prosedurnya melibatkan

menyiapkan pengenceran dua kali lipat dari agen antimikroba (mis. 1, 2, 4,

8, 16 dan 32 mg / mL) dalam medium pertumbuhan cair yang dikeluarkan dalam tabung

mengandung volume minimum 2 mL (macrodilution) atau dengan

volume yang lebih kecil menggunakan pelat mikrotitrasi 96-sumur (mikrodilusi)

(Gbr. 2). Kemudian, setiap tabung atau sumur diinokulasi dengan mikroba

inokulum disiapkan dalam media yang sama setelah pengenceran standar

suspensi mikroba disesuaikan dengan skala 0,5 McFarland

(Gbr. 3). Setelah pencampuran dengan baik, tabung diinokulasi atau 96-sumur

piring mikrotitrasi diinkubasi (kebanyakan tanpa agitasi) di bawah

kondisi yang cocok tergantung pada mikroorganisme uji

(Tabel 1). Metodologi eksperimental untuk melakukan secara akurat

mikrodilusi adalah skema pada Gambar. 4.

MIC adalah konsentrasi terendah agen antimikroba itu

sepenuhnya menghambat pertumbuhan organisme dalam tabung atau mikrodilusi

sumur yang terdeteksi oleh mata tanpa bantuan [56]. Berbeda dengan mikrodilusi

metode, kerugian utama macrodilution

metode yang membosankan, usaha manual, risiko kesalahan dalam

persiapan solusi antimikroba untuk setiap tes, dan

jumlah reagen dan ruang yang dibutuhkan relatif besar [11].

Dengan demikian, reproduksibilitas dan ekonomi reagen dan ruang

yang terjadi karena miniaturisasi tes adalah yang utama

keuntungan dari metode mikrodilusi. Namun demikian, yang terakhir

hasilnya secara signifikan dipengaruhi oleh pendekatan, yang harus

dikontrol dengan cermat jika hasil yang dapat direproduksi (intralaboratory dan

interlaboratory) harus dicapai [56]. Untuk penentuan

MIC endpoint, perangkat tampilan dapat memfasilitasi membaca mikrodilusi

menguji dan mencatat hasil dengan kemampuan tinggi untuk membedakan pertumbuhan di

sumur. Selain itu, beberapa metode kolorimetri berdasarkan

penggunaan reagen pewarna telah dikembangkan. Garam tetrazolium, 3- (4,5dimethylthiazol-2-yl) -2,5-

diphenyltetrazolium

bromida (MTT)

dan 2,3-bis {2-metoksi-4-nitro-5 - [(sulfenylamino) karbonil] -2Htetrazolium-hidroksida}

(XTT), sering digunakan di titik akhir MIC

penentuan untuk mikrodilusi antijamur dan antibakteri

tes [57-60]. Pewarna biru Alamar (resazurin), efektif

indikator pertumbuhan, juga dapat digunakan untuk tujuan ini [61-64].

Diketahui bahwa ukuran inokulum [65] adalah tipe pertumbuhan

sedang [66], waktu inkubasi dan persiapan inokulum

metode dapat memengaruhi nilai MIC [67,

68]. Oleh karena itu, dilusi kaldu

telah distandarisasi oleh CLSI untuk menguji bakteri yang tumbuh

aerobik [56], ragi [69] dan jamur berfilamen [70]. EUCAST

Metode pengenceran kaldu pada prinsipnya mirip dengan metode CLSI dengan

modifikasi biasanya menyangkut beberapa parameter uji seperti itu

sebagai persiapan inokulum, ukuran inokulum, dan pembacaan MIC

metode yang visual dalam uji CLSI dan spektrofotometri di

Pedoman EUCAST [71].

Mengenai conidium dan spora yang membentuk jamur, mikrodilusi

standar oleh CLSI melibatkan inokulum spora

disesuaikan secara spektrofotometri menjadi 0,4? 10

–5? 10

Namun, dalam uji EUCAST, inokulum dapat disesuaikan

(2–5)? 10

CFU / mL dengan penghitungan hemositometer [72]. Banyak sekali

penelitian menunjukkan pentingnya persiapan inokulum dengan hemositometer

menghitung untuk persiapan yang dapat direproduksi dan sesuai

terlepas dari warna dan ukuran konidia [68,73,74].

Penentuan konsentrasi bakterisida minimum

(MBC) atau konsentrasi fungisidal minimum (MFC), juga dikenal sebagai

konsentrasi mematikan minimum (MLC), adalah yang paling umum

estimasi aktivitas bakterisida atau fungisida. MBC didefinisikan

sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba yang diperlukan untuk membunuh

99,9% dari inokulum akhir setelah inkubasi selama 24 jam di bawah a

seperangkat kondisi standar yang dijelaskan dalam dokumen M26-A [75],

di mana MBC dapat ditentukan setelah kaldu macrodilution atau

mikrodilusi dengan mensubkultur sampel dari sumur atau tabung,

menghasilkan pertumbuhan mikroba negatif setelah inkubasi di permukaan

piring agar non-selektif untuk menentukan jumlah yang bertahan

sel (CFU / mL) setelah 24 jam inkubasi. Bakterisida

endpoint (MBC) telah didefinisikan secara subyektif sebagai konsentrasi terendah,

di mana 99,9% dari inokulum akhir terbunuh [75]. MFC

juga didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari obat yang menghasilkan

CFU / mL.

Efek membunuh 98% -99,9% dibandingkan dengan inokulum awal [71].

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk evaluasi yang berbeda

parameter uji untuk penentuan MFC berbagai obat terhadap

Isolat Candida [76], Aspergillus [77] dan cetakan lainnya [78].

4.2. Metode pengenceran agar

Metode pengenceran agar melibatkan penggabungan yang bervariasi

konsentrasi yang diinginkan dari zat antimikroba ke dalam agar-agar

media (media agar cair), biasanya menggunakan serial dua kali lipat

pengenceran, diikuti oleh inokulasi dari inokulum mikroba yang ditentukan

ke permukaan pelat agar. Titik akhir MIC direkam

sebagai konsentrasi terendah agen antimikroba yang sepenuhnya

menghambat pertumbuhan dalam kondisi inkubasi yang sesuai (Tabel 1).

Teknik ini cocok untuk antibakteri dan antijamur

pengujian kerentanan. Jika beberapa isolat sedang diuji terhadap a

senyawa tunggal, atau jika senyawa (atau ekstrak) yang diuji menutupi

deteksi pertumbuhan mikroba dalam medium cair dengan

pewarnaan, metode pengenceran agar sering lebih disukai daripada pengenceran kaldu

untuk penentuan MIC. Saat ini, diproduksi secara komersial

replikator inokulum tersedia dan dapat mentransfer antara 32

dan 60 inokula bakteri berbeda untuk setiap lempeng agar. Agar dilusi

sering direkomendasikan sebagai metode standar untuk rewel

organisme [79] seperti anaerob dan spesies Helicobacter. Memiliki

telah juga digunakan untuk kombinasi obat-agen antijamur melawan

Candida sp., Aspergillus, Fusarium dan dermatophytes [80-83].

Metode ini menyajikan korelasi yang baik dengan Etest terutama untuk

pengujian antibakteri terhadap Gram-positif dan Gram-negatif

bakteri. Selain itu, perbandingan kategori pengenceran agar,

metode mikrodilusi disk-difusi dan kaldu memberikan keunggulan

hasil [25].

5. Uji Time-kill (kurva time-kill)

Tes Time-kill adalah metode yang paling tepat untuk menentukan

efek bakterisida atau fungisida. Ini adalah alat yang kuat untuk memperoleh

informasi tentang interaksi dinamis antara antimikroba

agen dan strain mikroba. Tes pembunuhan-waktu mengungkapkan

antimikroba yang tergantung waktu atau tergantung konsentrasi

efek [55].
Untuk bakteri, tes ini telah terstandarisasi dan dideskripsikan dengan baik

dalam M26-A dokumen CLSI [75]. Ini dilakukan dalam budaya kaldu

sedang menggunakan tiga tabung yang mengandung suspensi bakteri

5? 10

CFU / mL. Tabung pertama dan kedua berisi molekul

atau ekstrak yang diuji biasanya pada konsentrasi akhir

0,25? MIC dan 1? MIC, dan yang ketiga dianggap sebagai

kontrol pertumbuhan. Inkubasi dilakukan dalam kondisi yang sesuai

untuk interval waktu yang bervariasi (0, 4, 6, 8, 10, 12 dan 24 jam) [21,55]. Kemudian,

persentase sel mati dihitung relatif terhadap pertumbuhan

kontrol dengan menentukan jumlah sel hidup (CFU / mL) masing-masing

tabung menggunakan metode penghitungan agar piring. Umumnya bakterisida

Efek diperoleh dengan persentase kematian 90% selama 6 jam, yang

setara dengan 99,9% dari kematian selama 24 jam [21]. Selain itu, ini

Metode dapat digunakan untuk menentukan sinergisme atau antagonisme antara

obat-obatan (dua atau lebih) dalam kombinasi [28,55]. Demikian pula,

beberapa zat antijamur dipelajari dengan metode ini [84,85].

6. Uji bioluminesensi ATP

Uji bioluminesensi ATP didasarkan pada kapasitas untuk mengukur

adenosine triphosphate (ATP) yang diproduksi oleh bakteri atau jamur. Sebagai

ATP adalah bentuk kimia energi semua sel hidup, hadir dalam

kurang lebih jumlah yang konstan dalam sel. Oleh karena itu, kuantifikasi

digunakan untuk memperkirakan populasi mikroba dalam sampel. Dluciferin

di hadapan ATP mengalami konversi oleh luciferase

untuk oxyluciferin yang menghasilkan cahaya. Kuantitas dari

cahaya yang dipancarkan diukur dengan luminometer dan dinyatakan sebagai

unit cahaya relatif (RLU) yang dapat dikonversi menjadi RLU / mol

ATP. Dengan demikian, ada hubungan linier antara viabilitas sel dan

luminesensi diukur.

Uji Bioluminescence memiliki berbagai aplikasi, seperti

sebagai uji sitotoksisitas [86], evaluasi in situ dampak biofilm

in situ [87], dan skrining obat pada Leishmania [88]. Apalagi itu

telah digunakan oleh beberapa penulis untuk pengujian antibakteri [89],

pengujian antimycobacterial [90,91], antijamur terhadap ragi [92] dan

cetakan [93]. Kecepatan adalah keunggulan utama dari teknik ini

yang memberikan hasil kuantitatif. Memang sudah dibuktikan

bahwa teknik ini dapat memberikan hasil dalam 3-5 hari untuk

tes antimycobacterial [90,91] dibandingkan dengan konvensional

teknik pengenceran, yang membutuhkan 3-4 minggu inkubasi

[90,91]. Uji Bioluminescence juga memiliki keuntungan menjadi

digunakan untuk pengujian antimikroba in vivo atau in situ [94].

7. Alirkan metode cyoroforometrik

Beberapa tahun yang lalu, kegunaan aliran cytometry untuk kerentanan

pengujian mikroorganisme disarankan. Demikian banyak

penulis menyelidiki aktivitas antibakteri dan antijamur

banyak obat yang menggunakan metodologi ini [95-98]. Deteksi cepat

sel yang rusak dengan pendekatan ini tergantung pada penggunaan yang tepat

pewarnaan pewarna [96,99]. Karena itu, propidium iodide (PI), a

Agen fluoresen dan interkalasi, banyak digunakan sebagai pewarna DNA

[96]. Beberapa penelitian dilaporkan pada keefektifan aliran

sitometer sebagai alat pengujian antibakteri terhadap minyak atsiri

Listeria monocytogenes, menggunakan pewarnaan gabungan dengan PI untuk

evaluasi kerusakan membran dan fluor karboksi fluor dalamin

(cFDA) untuk deteksi aktivitas esterase [95]. Akibatnya, sebagai tambahan

ke sel yang dilisiskan, tiga subpopulasi (mati, hidup dan terluka)

sel) dapat dengan jelas dibedakan dengan metode ini. Yang terluka

Sel-sel digambarkan sebagai sel-sel tertekan yang menunjukkan komponen seluler

kerusakan dan kerusakan reproduksi selanjutnya

pertumbuhan [100]. Kuantifikasi sel yang terluka memiliki hal yang menarik

hasil dalam mikrobiologi makanan, seperti subpopulasi ini

kritis jika pemulihan sel menjadi mungkin, seperti pada suhu

kondisi penyalahgunaan selama penyimpanan makanan [95]. Memang, mengalir cyto florometric

metode memungkinkan deteksi resistensi antimikroba

dan memperkirakan dampak molekul yang diuji pada

viabilitas dan kerusakan sel dari mikroorganisme yang diuji [101].

Selain itu, ini memberikan hasil yang dapat direproduksi dengan cepat (2-6 jam dibandingkan dengan

24–72 jam untuk metode mikrodilusi) [96]. Namun demikian,

sebarkan penggunaan metodologi ini untuk kerentanan antimikroba

pengujian saat ini muncul tidak mungkin karena tidak dapat diaksesnya

diperlukan peralatan aliran cytometry di berbagai laboratorium.

8. Kesimpulan

Saat ini, infeksi mikroba sudah menjadi hal yang penting

ancaman klinis, dengan morbiditas dan mortalitas terkait yang signifikan

yang terutama disebabkan oleh perkembangan resistensi mikroba terhadap

agen antimikroba yang ada. Oleh karena itu, metode untuk antimikroba

pengujian kerentanan dan menemukan antimikroba baru

agen telah banyak digunakan dan terus menjadi

dikembangkan. Beberapa teknik menjadi sasaran standardisasi oleh

CLSI dan EUCAST, menandai langkah besar yang luar biasa dalam hal ini

lapangan. Namun, ketika menguji produk alami, beberapa modifikasi

protokol standar sering diminta. Jadi, ini sangat penting

untuk berhati-hati agar tidak mengubah dasar-dasar mikrobiologi oleh

mengencerkan media kultur dan menggunakan yang sangat terkonsentrasi

inokulum. Apalagi jika kita mempertimbangkan penggunaan pelarut yang mungkin

mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme yang diuji, dapat kita katakan itu

membuat adaptasi metodologis kecil untuk protokol standar

dapat menjadi solusi untuk memastikan pendekatan eksperimental yang akurat

dan memungkinkan peneliti lain untuk membandingkan hasil.