FARMASI FMIPA UHAMKA 2011

Priyo Wahyudi

 Metode Difusi Agar  Metode Dilusi

 
 

Potensi Antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau g/mg Prinsip ; membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji Baku standar ; zat/senyawa yg sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya Cara analisis ;
Metode difusi agar (lempeng) Metode dilusi (Turbidimetri)

 

Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan pada sistem hayati (mikroorganisme) Mikroba yang digunakan adalah mikroorganisme yang telah diketahui kemurnian dan susceptibilitasnya Respon yang diamati ; berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang ditentukan oleh daerah bening (inhibition zone) di sekeliling zat uji (cara difusi) atau kekeruhan (turbiditas) yg ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba dalam medium cair (cara turbidimetri) menggunakan tabung reaksi dan spektrofotometer

1. CARA DIFUSI AGAR  Prinsip ; zat yang akan diuji berdifusi dari reservoir ke dalam medium agar yg telah diinokulasi dengan mikroba uji.  Inkubasi selama waktu tt dan kemudian amati adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan di ukur diameter hambatannya  Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan dengan diameter baku standar

2. CARA TURBIDIMETRI  Digunakan media cair, hambatan pertumbuhan mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan dengan spektrofotometer

Bahan-bahan yang diperlukan dalam uji potensi antibiotik:  Mikroba uji  Baku pembanding biologis  Media pertumbuhan  Larutan dapar (penyangga)

 Mikroba uji Mikroba uji harus berasal dari galur murni, dapat memberikan respon yg bertingkat antara peningkatan konsentrasi dgn peningkatan daerah hambatannya. Untuk cara difusi, daerah hambatan yg terbentuk harus jelas dan mudah diukur. Untuk penetapan cara tabung, perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas  Baku pembanding biologis (biological reference) ; Digunakan antibiotik yg telah diketahui kemurnian dan potensinya secara pasti. Baku pembanding ini direkomendasikan oleh WHO dan di Indonesia seperti BPOM, SPI, SPN, SBL (S=standar, B=baku, P=pembanding, L=lab, I=intern)

 Media pertumbuhan Media yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji dgn baik, tidak boleh mengandung zat yg bersifat antagonis ataupun yg mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotik yg diperiksa  Larutan dapar Digunakan untuk melarutkan antibiotik yang akan diperiksa baik baku pembanding maupun sampel uji. Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yabg akan diuji.

 Biasanya digunakan 3 tingkatan dosis, baik untuk sediaan uji (u) atau pembanding (s); u1, u2, u3 dan s1, s2 , s3  Pengulangan dilakukan msg-msg 2-8x untuk cara difusi dan 2-6x untuk cara turbidimetri  Tingkatan dosis harus tetap, misal kenaikan dosis dari u1 u2 = 4/3. jika u1 = 5 g/mg , u2 = 4/3 x 5 g/mg = 6,67 g/mg. u3 = 4/3 x 6,67 = 8,89 g/mg ; begitu juga dengan s1, s2 dan s3

 Metode analisis potensi antibiotik secara difusi agar merupakan cara yang sederhana dan hasil yg diperoleh cukup teliti.  Cara ini mrp cara terpilih dan direkomendasikan oleh International Collabotrative Study di Swedia dan FDA di AS untuk pengujian mutu antibiotik  Prinsip penetapannya yaitu mengukur luas hambatan pertumbuhan mikroba uji yg disebabkan oleh zat baku standar dan zat yg di uji  Dlm range konsentrasi tt terdapat hub yg linear antara peningkatan konsentarsi dgn luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji

      

Ingredien / komposisi medium pertumbuhan Pemilihan medium pertumbuhan Pengaruh pH Ukuran inokulum Stabilitas mikroba uji Aktivitas antibiotika Waktu inkubasi

 Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo adalh ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)  NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin  KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau ampisilin

 Pemilihan medium pertumbuhan; dimana diperlukan persiapan medium yg cocok bagi pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada medium agar  Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa  Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N

 Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.  Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar kandungan mikroorganismenya.  Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganismenya homogen, misal 1-10%  Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan terjadinya penumpukan pada tempat tt

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.

Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat minimum (KHM) dari antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam medium agar

Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara 18-24 jam

 Resevoir pada Teknik difusi agar dapat berupa:  Silinder gelas / logam  Cakram kertas (paper disc)  Cetak lobang (punched holes)  Cakram : tempat meletakkan sampel antimikroba yang akan diuji potensinya pada medium agar yang telah memadat

 Antimicrobial drugs are widely used for the treatment of infectious diseases.  Pathogens should be tested for susceptibility to individual antibiotics to ensure appropriate chemotherapy. This rigorous approach to antimicrobial drug treatment is usually applied only in health care settings.

The standard procedure that assesses antimicrobial activity is called the KirbyBauer method (Figure 24.8).

 Agar media are inoculated by evenly spreading a defined density of a suspension of the pure culture on the agar surface. Filter paper disks containing a defined quantity of the antimicrobial agents are then placed on the inoculated agar.  After a specified period of incubation, the diameter of the inhibition zone around each disk is measured. Table 24.4 presents zone sizes for several antibiotics.

 Antibiograms are periodic reports that indicate the susceptibility of clinically isolated organisms to the antibiotics in current local use.

 Explain how to implement current NCCLS antimicrobial susceptibility testing (AST) and reporting recommendations.  Describe reliable methods for detecting resistance among:
     Enterobacteriaceae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus spp. Streptococcus pneumoniae and Streptococcus spp.

 Describe effective reporting of AST results.  List steps that can be taken to verify AST results obtained on bacteria isolated from patients.  Discuss NCCLS-recommended QC procedures and how to trouble-shoot out-of-control QC results

     

Which organisms to test? What methods to use? What antibiotics to test? How to report results? How to determine the clinical significance of results? How to ensure accuracy of results?
 Quality control / quality assurance

 When to call the MD, infection control, public health?  When to ask for help?  Where to go for help?

 Disk diffusion (Kirby Bauer)  Broth micro-dilution MIC

 NCCLS reference method

 Etest

Disk Diffusion Test

Prepare inoculum suspension

Select colonies

Mix well

Standardize inoculum suspension

Swab plate

Remove sample

Incubate overnight

Add disks

Transmitted Light

Reflected Light

 Qualitative results
 Susceptible  Intermediate may respond if infection is at body site where drug concentrates (e.g. urine) or if higher than normal dose can be safely given  Resistant

      

Endocarditis Meningitis Septicemia Osteomyelitis Immunosuppressed patients (HIV, cancer, etc.) Prosthetic devices Patients not responding despite S

 Minimal inhibitory concentration  The lowest concentration of antimicrobial agent that inhibits the growth of a bacterium  Interpret:
 Susceptible  Intermediate  Resistant

 Standardize inoculum suspension  Final inoculum concentration

 3 5 x 105 CFU/ml  (3 5 x 104 CFU/well)

Prepare inoculum suspension

Microdilution MIC tray

Dilute & mix inoculum suspension

Pour inoculum into reservoir and inoculate MIC tray

Incubate overnight

Inoculate purity plate

Reflected light

Transmitted light

 Sub final test suspension to non-selective medium (after inoculating MIC test)  Streak for isolation (avoid several specimens per plate - may not reveal contaminants if no isolated colonies)  Examine before reading MIC (usually at 16-20 h)  Re-incubate if antibiogram questionable

0.5 1 2 4 8 16 32 64

- +

>64

>64

 Staphylococci oxacillin, vancomycin, cefoxitin  Enterococci vancomycin  Resistance may be reported any time growth is observed after a minimum of 16 h incubation  After minimum of 16 h, read test:
 if R, report  If S, re-incubate and read again at 24 h

NCCLS M2-A8, M7-A6 M2M7-

MIC on a strip
abbiodisk.com

 Viridans Streptococcus penicillin  S. pneumoniae penicillin, cefotaxime/ceftriaxone (sterile sites)  Enterococcus vancomycin Int results  Staphylococcus vancomycin zone e14 mm