Tanggal Praktikum 8 Mei 2014

Praktikum Uji Kadar Hambat Minimum & Kadar Bunuh Minimum

Tujuan Praktikum Menetukan Kadar Hambat Minimum (KHM dari suatu
antibiotik secara dilusi
Menetukan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dari suatu
antibiotik secara dilusi
Kelompok 1 (satu)
Nama Anggota 1. Ade Muchlas Wijayanto
2. Dewi kartika sari
3. Neni maulina wijayati
4. Petrisia putri romadhon
5. Risa anggraini
6. Yohana rafiqah

Dasar Teori
Antibiotik
Antibiotika adalah segolongan senyawa, baik alami maupun sintetik, yang
mempunyai efek menekan atau menghentikan suatu proses biokimia di dalam
organisme, khususnya dalam proses infeksi oleh bakteri. Penggunaan antibiotika
khususnya berkaitan dengan pengobatan penyakit infeksi, meskipun dalam bioteknologi
dan rekayasa genetika juga digunakan sebagai alat seleksi terhadap mutan atau
transforman.
Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antibiotic yang bersifat menghambat
pertumbuhan mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik, dan ada yang bersifat
membunuh mikroba, dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Kadar minimal yang
diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba atau membunuhnya masing-
masing dikenal sebagai Kadar Hambat Mikroba (KHM) dan Kadar Bunuh Mikroba
(KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi
bakterisid bila kadar antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM.
Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti
bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Umumnya
toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bukan absolut, ini berarti bahwa suatu obat
yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi oleh inang namun dapat merusak
parasit.
Aktivitas mikroba dapat dikendalikan dengan mengatur faktor-faktor lingkungan
yang meliputi faktor biotik (makhluk hidup dan mencakup adanya asosiasi atau
kehidupan bersama antara mikroorganisme dapat dalam bentuk simbiose, sinergisme,
antibiose, dan sintropisme) dan abiotik (temperatur, kelembaban, pH, radiasi,
penghancuran secara mekanik). Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi
syarat-syarat berikut:
1. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat pertumbuhan
mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotik).
2. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme pathogen.
3. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada host, seperti
reaksi alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan sebagainya.
4. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora usus atau
flora kulit.

Mekanisme kerja antibiotik
Pemusnahan mikroba dengan antibiotika yang bersifat bakteriostatik masih
tergantung dari keanggupan reaksi daya tahan tubuh hospes. Peranan lamanya kontak
antara mikroba dengan antimikroba dalam kadar efektif juga sangat menentukan untuk
mendapatkan efek, khususnya pada tuberkolostatik.
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibiotika dibagi dalam lima kelompok :
1. Yang mengganggu metabolism sel mikroba.
2. Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba.
3. Yang mengganggu permeabilitas membrane sel mikroba.
4. Yang menghambat sintesis protein sel mikroba.
5. Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba.
Resistensi
Secara garis besar kuman dapat menjadi resisten terhadap suatu antibiotika
melalui 3 mekanisme :
1. Obat tidak dapat mencapai tempat kerjanya didalam sel mikroba. Pada kuman Gram
negatif molekul antibiotika yang kecil dan polar dapat menembus dinding luar dan
masuk kedalam sel melalui lubang-lubang kecil yang disebut porin. Bila porin
menghilang atau mengalami mutasi maka masuknya antibiotika ini akan terhambat.
Mekanisme lain adalah kuman mengurangi mekanisme transfor aktif yang
memasukan antibiotika kedalam sel. Mekanisme lain adalah mkroba mengaktifkan
pompa efluks untuk membuang keluar antibiotic dalam sel.
2. Inaktivasi obat : mekanisme ini sering mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap
golongan aminoglikosida dan beta laktam karena mikroba mampu membuat enzim
yang merusak kedua golongan antibiotika tersebut.
3. Mikroba mengubah tempat ikatan antibiotika : mekanisme ini terlihat pada S.aureus
yang rsisten terhadap metisilin. Kuman ini mengubah penicillin binding proteinnya
sehingga afinitasnya menurun terhadap metisilin dan antibiotika beta laktam yang
lain.
Metode Dilusi
Cara ini digunakan untuk menetukan kadar hambat minimum (KHM) dan kadar
bunuh minimum (KBM) dari obat antibiotik.
Prinsip dari metode ini ialah menggunakan satu seri tabung reaksi yang diisi media
cair dan sejumlah tertentu selmikroba yang diuji. Setelah itu, masing-masing tabung diuji
dengan obat yang telah diencerkan secara serial. Seri tabung diinokulasi pada suhu 361
o
C
selama 18-24 jam dan diiamati terjadi kekeruhan pada tabung konsentrasi terendah obat, pada
tabung yang ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan koloni mikroba adalah KBM dari
obat terhadap bakteri uji. Uji kepekaan cara dilusi agkr memakan waktu dan penggunaannya
dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair adalah bahwa uji ini
member hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antibakteri yang dibutuhkan untuk
mematikan bakteri.
Untuk KHM sendiri, merupakan konsentrasi minimal dari satu zat yang akan
menghambat pertumbuhan suatu mikroorganisme. KHM ini digunakan oleh laboratorium
doagnostik terutama untuk kosistensi resistansi, yang paling sering digunakan sebagai alat
penelitian untuk menentukan aktivitas in-vitro antimikroba baru.
Kadar Hambat Minimum atau lebih lebih dikenal dengan MIC (Minimal Inhibitory
Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antimikroba yang dapat menghambat
petumbuhan mikroba tertentu. Nilai MIC adalah spesifik untuk tiap-tiap kombinasi dari
antibiotic dan sentivitas dari mikroba terhadap antimikroba. Nilai MIC berlawanan dengan
sentivitas mikroba yang diuji. Semakin rendah nilai MIC dari sebuah antimikroba,
sensitivitas dari bakteri akan semakin besar. MIC dari sebuah antibiotik terhadap spesies
mikroba adalah rat-rata KHM terhadap seluruh strain dari spesies tertentu. Strain dari
beberapa spesies mikroba adalah sangat berbeda dalam hal sensitivitasnya. Metode uji
antimikroba yang sering digunnakan adalah metode difusi lempeng agar. Uji ini dilakukan
pada permukaan medium padat. Mikroba ditumbuhkan pada permukaan medium dan kertas
saring yang dibentuk cakram yang telah mengandung mikroba. Setelah inkubasi, diameter
zona penghambatan diukur. Diameter zona penghambatan merupakan pengukuran KHM
secara tidak langsung dari antibiotic terhadap mikroba. Sensitivitas klinik dari mikroba
kemudian ditentukan dari tabel klasifikasi (Jawestz, et al. 1996).


Kadar Hambat Minimal (KHM) antibiotik
Penentuan kepekaan mikroba terhadap suatu antibiotika atau khemoterapeutik
dipakai untuk menentukan pengobatan terbaik terhadap penyakit yang disebabkan oleh
suatu mikroba tersebut pada manusia atau hewan. Ada dua metode untuk menentukan
kadar hambat minimal suatu antibiotika yaitu :
1. Metode Difusi
Pada metode ini zat antibiotika berdifusi pada lempeng agar yang telah diinokulasi dengan
bakteri. Dasar pengamatannya adalah terbentuk zona hambat disekeliling cakram atau
silinder yang berisi antibiotika. Metode ini dipengaruhi oleh faktor fisik dan kimia, selain
antara obat dan organisme.
o Cara parit
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan baktei dibuat parit kemudian
diisi dengan zat antibiotika dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu sesuai dengan
jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas ada atau tidaknya hambatan disekeliling
parit.
o Cara silinder
Pada medium agar yang telah diinokulasi dengan bakteri dibuat lubang diletakan
silinder kemudian diisi dengan zat antibakteri, setelah itu diinkubasi pada suhu dan
jangka waktu yang sesuai dengan jenis bakteri uji. Pengamatan dilakukan atas dasra ada
atau tidaknya hambatan disekeliling silinder.
o Cara cakram
Kertas cakram yang mengandung zat antibakteri diletakan diatas lempeng, setelah
diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan bakteri uji. Pengamatan
dilakukan berdasarkan ada tidaknya hambatan disekeliling cakram

2. Metode dilusi
Metode ini menggunakan antibakteri yang turun secar bertahap, baik dengan media cair atau
padat kemudian media diinokulasi bakteri uji dan dieramkan. Dasar pengamatannya adalah
dengan melihat tumbuh atau tidaknya bakteri.
o Cara pengenceran tabung (Metode Kirby-Bauer)
Pada metode ini zat yang akan diuji kepekaan antibakterinya diencerkan secar
serial dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium cair, kemudian
diinokulasikan dengan bakteri uji, inkubasi pada suhu 37C selama 18-21 jm ( untuk
bakteri) dan 1-2 minggu (untuk jamur). Aktivitas antibakteri ditentukan sebagai
konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
o Cara penapisan lempeng
Pada metode ini zat yang akan diuji antibakterinya diencerkan secara serial
dengan pengenceran kelipatan dua dalam medium agar pada suhu 40-50C, kemudian
dituang dalam cawan petri. Setelah lempeng agar membeku ditanam inokulum bakteri
dan diinkubasi pada suhu dan jangka waktu yang sesuai dengan pertumbuhan bakteri uji.
Kadar hambat minimum zat antibakteri yang diuji, ditentukan sebagai konsentrasi
terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.
o Turbiditas
Pada metode ini pengamatann aktivitas didasarkan atas kekeruhan yang terjadi
pada medium pembenihan. Pertumbuhan bakteri juga dapat ditentukan dari perubahan
yang terjadi sebelum dan sesudah inkubasi, yang dilakukan dengan mengukur
serapannya secara spektrofotometer. Adanya pertumbuhan bakteri ditandai dengan
peningkatan jumlah sel bakteri, yang mengakibatkan meningkatnya kekeruhan.
Kekeruhan yang terjadi umumnya berbanding lurus dengan serapan.
Cara Lain Pengujian KHM
1. Pembuatan Lapisan Dasar ( Base Layer)
Siapkan cawan petri steril, setiap cawan diisi 10ml base layer, usahakan merata
memenuhi seluruh permukaan petri. Biarkan membeku.
2. Pembuatan Lapisan Pembenihan
Siapkan 6 tabung reaksi masing-masing tabung dengan 4ml lapisan pembenihan cair,
ratakan sehingga menutupi lapisan base layer. Tunggu sampai mengeras 1ml suspense
kuman dari pengenceran 1000x, ratakan dengan menggunakan spatel drugalsky.
3. Pemasangan Silinder (Cakram Kertas)
Letakkan silinder glass atau kertas cakram, diatas permukaan agar dengan jarak satu
sama lin 20-35mm. Inkubasi 24 jam suhu 37C hitung diameter zona bening yang
terbentuk dengan menggunakan jangka sorong.

Penetuan Kadar Bunuh Minimum (KBM)
KBM ditentukan dengan cara mengambil suspense dengan menggunakan ose dari
tabung-tabung digunakan untuk menetukan nilai KHM dan menyebarkannya pada lempeng
agar Muller-Hinton secara sektoral. Lempeng tersebut di inkubasi di inkubator selama 24 jam
pada suhu 37
o
C. Konsetrasi terendah yang tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri adalah
nilai KBM. KBM merupakan kadar minimal yang diperlukan antibiotika untuk membunuh
mikroba.

Alat dan Bahan
Alat : Bahan :
Spektrofotometer Aquades
Tabung reaksi Media Lactose Broth (LB)
Rak tabung reaksi Media Eosin Methilene Blue (EMB)
Botol semprot NaCl steril
Beaker glass Ampisillin
Erlenmeyer Bakteri Escherichia coli
Cawan petri Aquades steril
Pipet nikrom Alkohol
Lampu spirtus
Kaki tiga
Kasa asbes


1) Prosedur Kadar Hambat Minimum
a. Diambil 1 ose biakan E. Coli
b. Disuspensikan dengan NaCl 0,9% (50 ml) ke dalam erlenmeyer
c. Diuji konsentrasi dengan spektrofotometer dengan A= 580 nm hingga diperoleh
25% T
d. Pembuatan larutan stok antibiotik 500 mg/1 tablet dalam/2 tablet untuk satu kelas
dalam 30 mL

aquades steril

AB 3,5 m AB 3,15 ml AB 2,8 ml AB 2,45 AB 2,1 ml
e.



3,5 mL 3,85 mL 4,2 mL 4,45 mL 4,9 mL kontrol
media
Media yang digunakan yaitu media lactose broth
f. Masing-masing tabung diisi dengan 1 ml suspensi bakteri
g. Diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37
o
C, lakukan pengamatan kekeruhan.
NB: jika keruh maka antibiotik tsb tidak dapat menghambat bakteri E. Coli dan
sebaliknya
2) Prosedur Kadar Bunuh Minimum
Diambil 1 mL suspensi KHM dengan menggunakan pipet, ditanam pada media
EMB dengan metode pour plate

10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
kontrol
- Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C
-
Diamati pada konsentrasi berapa antibiotik mampu membunuh mikroorganisme
(KBM), dilihat apakah ada koloni yang tumbuh atau tidak. Mulai dari konsentrasi
10
-1
sampai dengan konsentrasi 10
-5
- NB: semakin sedikit bakteri yang tumbuh, maka semakin besar daya bunuh
antibiotik terhadap bakteri E. Coli