LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

PRAKTIKUM VII

Uji Aktivitas Antimikroba : Metode Dilusi Padat

Disusun Oleh :
Nama / NIM

: 1. Nimas Ayu / 10129

2. Almira Rahmayani / 10132
3. Bambang Hidayat / 10135
4. Siti Muntadliroh / 10138
5. Retika Gien Syaputri / 10141

Kelas / Golongan

: B / IV

Tanggal Praktikum

: 4 Mei 2015

Dosen Jaga

Asisten

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA

2015
A. Tujuan
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat menentukan kadar
hambat minimum dan kadar bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji.
B. Dasar Teori
Antibiotika adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh organisme hidup,
termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang dibuat secara sintetik, dan
dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dalam kehidupan satu
spesies atau lebih mikroorganisme. (Soekardjo dkk, 200)
Hal yang paling penting mengenai konsep antimikrobia adalah selective
toxicity yaitu selektif dalam menghambat pertumbuhan organisme tanpa merusak
inang. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri dan
manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia, sehingga
antibiotik dengan mekanisme kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai toksisitas
selektif relatif tinggi. (Ganiswarna, 1995)
Berdasarkan toksisitas selektif ada antibakteri yang bersifat bakteriostatik dan
bakterisid. Kelompok yang pertama menghambat pertumbuhan atau perkembangan
bakteri, kelompok yang kedua bekerja mematikan bakteri. Bakterisid merupakan
antibiotik yang mempengaruhi pembentukan dinding sel atau permeabilitas membran,
sedang bakteriostatik adalah antibiotik yang bekerja pada sintesa protein. Antibakteri
tertentu aktivitasnya dapat meningkat dan bakteriostatik menjadi bakterisid bila kadar
antibakterinya ditingkatkan melebihi KHM. (Setiabudi, 1995)
Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Minimum Concentration (MIC) adalah
kadar minimal yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sedangkan
konsentrasi terendah dari antibiotik yang membunuh 99,9% inokulum bakteri disebut
Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimum Killing Concentration (MCK).
(Brander, 1991)
Mekanisme kerja sebagian besar antibiotik dapat dibagi menjadi 5 cara :
1. Menghambat pembentukan dinding sel, contoh: penisilin, ampisilin, metsilin,
2.
3.
4.
5.
6.

sefalosforin.
Mengganggu pembentukan membran sel, contoh : polimiksin B.
Menghambat sintesis protein, contoh: streptomisin, gentamisin, kloramfenikol.
Menghambat sintesis asam nukleat, contoh : siprofloksazin, nifampin.
Antagonis metabolit, contoh : isoniazid.
Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas antimikroba yaitu pH lingkungan,
komponen-komponen perbenihan, stabilitas obat, besarnya inokulum bakteri,

masa pengeraman, dan aktivitas metabolik mikroorganisme. (Jawetz et al.,

1995)
Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi
padat (solid dilution). Metode dilusi cair (broth dilution) mengukur MIC (Minimum
Inhibitory Concentration) atau KHM (Kadar Hambat Minimum) dan MBC (Minimum
Bactericidal Concentration atau Kadar Bunuh Minimum, KBM). Metode dilusi padat
(solid dilution) serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan metode padat.
Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang di uji dapat
digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).
Pada metode dilusi cair, masing-masing konsentrasi antimikroba obat antibiotik
ditambah suspensi bakteri, sedang dalam dilusi padat pada tiap konsentrasi dicampur
dengan media agar lalu ditanam bakteri, diinkubasi 24 jam.
Pada dilusi padat, prinsipnya adalah sejumlah antimikroba diencerkan hingga
diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi padat tiap konsentrasi obat dicampur
dalam media agar, lalu ditanami bakteri dan diinkubasi. Setelah masa inkubasi selesai,
diperiksa konsentrasi berapa obat dapat menghambat pertumbuhan atau mematikan
mikroba. (Pelczar, 1988).
Keuntungan dari metode dilusi padat adalah bisa menguji lebih dari satu mikroba
uji dalam setiap cawan petri, sedang kelemahannya adalah sulit membedakan antara
aktivitas penghambat (KHM) atau mematikan mikroba uji (KBM). Sedangkan pada
dilusi cair memiliki keuntungan dapat ditentukan KHM dan KBM secara jelas,
sedangkan kerugiannya adalah hanya dapat menguji satu mikroba uji dalam setiap
cawan petri.
Bakteri yang diamati praktikan pada praktikum ini adalah sebagai berikut.
1. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif berbentuk bulat
berdiameter 0,7-1,2 m, tersusun dalam kelompok-kelompok yang tidak teratur
seperti buah anggur, fakultatif anaerob, tidak membentuk spora, dan tidak
bergerak. Bakteri ini tumbuh pada suhu optimum 37 C, tetapi
membentuk pigmen paling baik pada suhu kamar (20-25 C). Koloni pada
perbenihan padat berwarna abu-abu sampai kuning keemasan, berbentuk bundar,
halus, menonjol, dan berkilau. Lebih dari 90% isolat klinik menghasilkan S.
aureus yang mempunyai kapsul polisakarida atau selaput tipis yang berperan
dalam virulensi bakteri (Jawetz et al., 1995 ; Novick et al., 2000)

Ilustrasi Bakteri Staphylococcus aureus

2. Eschericia Coli
E. coli adalah adalah salah satu jenis spesies utama bakteri gram negatif.
berbentuk batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 m, diameter 0,7 m,
lebar 0,4-0,7m dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang
bundar, cembung, dan halus dengan tepi yang nyata. (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz
et al., 1995). Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini
dapat ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E. Coli tidak berbahaya,
tetapi beberapa, seperti E. Coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan
makanan yang serius pada manusia. E. Coli yang tidak berbahaya dapat
menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan
mencegah bakteri lain di dalam usus (Anonim, 2011).

Ilustrasi bakteri E.coli

Minyak atsiri adalah suatu substansi alami yang telah dikenal memiliki
aktivitas sebagai antibakteri. Bahkan minyak atsiri cengkeh telah digunakan sejak
lama di berbagai rumah sakit Eropa untuk mengatasi infeksi Mycobacterium
tuberculosis (Yulliasri dkk., 2000). Minyak atsiri dapat menghambat beberapa
jenis bakteri merugikan seperti Escherichia coli, Salmonella sp, Staphylococcus
aureus,
Klebsiella, dan Pasteurella (Agusta, 2000). Dilaporkan dalam berbagai penelitian
bahwa minyak cengkeh adalah mengandung eugenol, ketika diuji pada beberapa
jenis bakteri memiliki sifat antibakteri dan memperlihatkan penghambatan pada
L. monocytogenes,

Campylobacter jejuni, S.enteridis, E.coli dan S.aureus

(Beuchat, 2000; Cressy et al., 2003; Smith-Palmer et al., 1998). Selanjutnya

ditambahkan oleh Frosch et al., (2002) bahwa penelitian terbaru menunjukkan
aktivitas antibakteri minyak cengkeh dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen : A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P.melaninogenica, P.
gingivalis, C. gingivaiis and F. nucleatum. Juga mampu menghambat
pertumbuhan Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, dan
Staphylococcus aureus. Dilaporkan oleh Smith et al.,(1998 dan 2001) bahwa
minyak cengkeh efektif menghambat L. monocytogenes dan S. enteridis dalam
TSB dan keju.
C. Alat dan Bahan
Alat:
Cawan petri
Tabung reaksi
Mikropipet dan yellow tip
Glass spreader
Mikropipet dan tips
Eppendorf
Lampu spiritus
Korek api

Bahan:
Minyak atsiri : adas dan cengkeh
Pelarut DMSO
Media NA atau Mueller Hilton
Mikroba (Staphlococcus aureus dan
Eschericia coli)

D. Cara Kerja
Sampel uji (minyak atsiri kadar 205 v/v dalam DMSO) dibuat 6 kadar seri pengenceran
kadar kelipatan secara aseptis

Disiapkan kontrol uji

Pembuatan kontrol uji dan pembuatan seri kadar dilakukan seperti pada P-6

Dari setiap seri pengenceran diambil 1 ml untuk kemudian ditambahkan 9 ml media agar
Mueler Hinton di dalam petri, kemudia digoyang dan dibiarkan memadat. 1 cawan petri
untuk 1 kadar

Didapat 1 seri 6 petri media yang sudah padat, kemudian dibagi media menjadi 2 bagian
dengan cara menggaris bagian bawah cawan dengan spidol

Digoreskan 1 ose suspensi bakteri yang berbeda pada setiap bagian. Bakteri uji yang
digunakan adalah E. Coli dan S. Aureus

Diinkubasi selama 24 jam

Diamati koloni bakterinya

E. Hasil Pengamatan
Seri kadar 1%
SA
E.coli

: terbentuk koloni, keruh

: terbentuk koloni, keruh
Koloni terbentuk paling sedikit pada seri kadar ini.

Seri kadar 0,5%

SA
E.coli

: terbentuk koloni, keruh

: terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,25%

SA

: terbentuk koloni, keruh

E.coli

: terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,125%

SA

: terbentuk koloni, keruh

E.coli

: terbentuk koloni, keruh

Seri kadar 0,0625%

SA

: terbentuk koloni, keruh

E.coli

: terbentuk koloni, keruh

F. Pembahasan
Tujuan praktikum ini adalah menentukan kadar hambat minimum dan kadar
bunuh minimum dari suatu sampel terhadap mikroba uji. Dalam praktikum ini,
digunakan 1 macam ekstrak tumbuhan, yaitu minyak atsiri
Langkah pertama adalah membuat larutan stok dari minyak atsiri sebanyak 50 l
dalam metanol 500 l dan dimasukkan ke dalam eppendorf menggunakan mikropipet
dan yellow tip. Minyak atsiri inilah yang memiliki aktivitas antimikroba atau
fungistatik. Setelah itu diambil 30 l larutan stok tersebut dan diencerkan 1470 l
akuades di dalam eppendorf kedua sehingga diperoleh sampel uji yang mengandung
1% v/v minyak atsiri. Lalu diambil 750 dari sampel uji 1% v/v minyak atsiri tersebut
dan dimasukkan ke eppendorf ketiga sehingga diperoleh sampel uji yang mengandung
0,5% v/v minyak atsiri Dengan cara yang sama dibuat sampel uji yang mengandung;
0,25% ; 0,125% ; 0,0625% v/v minyak atsiri. Pada seri 0,0625% dibuang 750 l juga,
sehingga menghasilkan suatu buangan, agar semua seri pengenceran memiliki volume

yang sama yaitu 750 l. Setelah itu, atau bisa dilakukan sembari melakukan seri untuk
menghemat waktu, dicairkan media agar NA dengan cara memanaskannya di atas
kompor listrik. Setelah mencair, lalu ditunggu hingga suhunya sudah tidak terlalu
tinggi dan cukup dingin. Setelah semuanya siap langkah berikutnya dilakukan di
dalam LAF (Laminair Air Flow) secara aseptik. Lalu dibagi permukaan petri menjadi
2 bagian dengan menggaris bagian bawah petri dengan spidol untuk menguji 2
bakteri, yaitu Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Setelah itu, masing-masing
eppendorf yang berisi hasil pengenceran minyak atsiri dituangkan seluruh volumenya
ke masing- masing cawan petri yang totalnya berjumlah 5 cawan petri. Sebelum diisi
seri pengenceran, masing-masing cawan petri diberi dulu media agar NA sebanyak 9
ml.
Setelah semua media dalam cawan petri memadat, kemudian digoreskan suspensi
bakteri uji yang berbeda untuk setiap bagian bakteri uji yang digunakan dalam
larutan salin menggunakan ose yang dipanaskan dahulu mengguakan bunsen sampai
merah membara untuk menghindari kontaminasi. Menggoreskan suspensi bakteri
dilakukan dengan arah zig-zag agar mempermudah dalam mengetahui koloni bakteri
yang akan diamati. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

yang

merupakan suhu yang optimum untuk pertumbuhan bakteri.

Setelah diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37C, cawan petri
dikeluarkan dan diamati. Pada pengamatan, terlihat adanya permukan jernih dan
keruh. Jika terdapat koloni bakteri (keruh) pada bagian yang digoreskan maka bakteri
tersebut resisten terhadap sampel uji yaitu minyak atsiri dari cengkeh. Dan jika tidak
terdapat koloni bakteri pada bagian yang digoreskan suspensi bakteri maka bakteri
tersebut tepengaruh oleh adanya antibiotik pada sampel uji dan media.
Hasil yang diperoleh adalah adanya koloni bakteri di masing-masing cawan petri.
Dengan hasil kadar pengenceran 1% mempunyai koloni bakteri yang paling sedikit.
Hal ini dapat menunjukkan minyak atsiri yang digunakan memberikan hasil negatif
terhadap uji aktivitas antimikroba. Hal ini tidak sesuai dengan teori karena minyak
atsiri telah sudah lama dikenal memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Ketidaksesuain
praktikum dengan teori dapat dikarenakan adanya ketidaktelitian dan ketidakcermatan
praktikan dalam percobaan, seperti kesalahan jumlah pengambilan sampel dengan
mikropipet, proporsi media NA yang lebih banyak sehingga kadar minyak atsiri

menjadi sangat kecil dan sulit menunjukkan aktivitas antimikroba yang dimiliki,
ataupun hal lain yang praktikan tidak sadari.
G. Kesimpulan
1. Uji aktivitas antimikroba pada praktikum ini menggunakan metode dilusi padat
2. Metode dilusi padat memiliki keuntungan dapat menguji lebih dari satu mikroba
uji dalam setiap cawan petri dan kelemahannya adalah sulit membedakan antara
aktivitas penghambatan dan mematikan mikroba uji.
3. Sampel antimiroba yang dipakai adalah minyak atsiri dan mikroba uji yang
digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
4. Hasil menunjukkan minyak atsiri yang digunakan memberikan hasil negatif
terhadap uji aktivitas antimikroba karena masih adanya koloni bakteri di masingmasing cawan petri.
H. Daftar Pustaka
Brander, G.C., Pugh, D.M., Baywater, R.J., and Jenkins, W.C., 1991. Veterinary
Applied Pharmacology and Therapeutics 5th ed, The English Book Society and
Baillere Tindal, London.
Beuchat, L. R. 2000, Control of Foodborne Pathogens and Spoilage Microorganisms
by Naturally Occurring Antimicrobials. In C. L.Wilson & S. Droby (Eds.),
Microbial Food Contamination. Boca Raton, FL: CRC Press. pp. 149169
Cressy, H. K., Jerrett, A. R., Osborne, C. M., & Bremer, P. J, 2003, A Novel Method
for the Reduction of Numbers of Listeria Monocytogenes Cells by Freezing in
Combination with an Essential Oil in Bacteriological Media, J. of Food Protection,
66, 390395.
Frosch, P. J. , J.D. Johansen, T. Menn, C. Pirker, S.C. Rastogi, K.E, 2002, Essesnsial
oil and antimicrobia review, Vol. 47(5): 279-287, Nov 2002.
Ganiswara, 1995, Farmakologi dan Terapan Edisi IV, Bagian Farmakologi Fakultas
Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta.
Jamal, Yuliasri dan Agusta, 2000, Komposisi Kimia Minyak Atsiri Neolitsea cassia
dan Nectandra angustifolia (Lauraceae), Prosiding Seminar PERHIPBA
Pemanfaatan Obat Alami III

Jawetz, E., J.L. Melnick., E.A. Adelberg., G.F. Brooks., J.S. Butel., dan L.N. Ornston.
1995. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi ke-20 (Alih bahasa : Nugroho &
R.F.Maulany), Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta
Pratiwi, 2008, Uji Aktivitas Anti Mikroba, http://etd.ugm.ac.id/index.php?, diakses
pada tanggal 10 Mei 2015, pukul 8.15
Setiabudy, R dan Gan, V.H.S. 1995, Farmakologi dan Terapi, Edisi Keempat, Bagian
Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.
Smith-Palmer, A., Steward, J., & Fyfe, L, 1998, Antimicrobial Properties of Plant
Essential Oil and Essences Against Five Important Food-borne Pathogen, Letters
in Applied Microbiology (26) : 118122.
Soekardjo, B., Hardjono, S., Sondakh, R., 2000, Kimia Medisinal, Edisi Kedua,
Airlangga University Press, Surabaya.

Mengetahui,
Asisten Koreksi

Yogyakarta, 16 Maret 2015

Praktikan