BAKTERIOLOGI III

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI CAMPURAN GRAM

POSITIF (+) DAN GRAM NEGATIF (-)

(Staphylococcus aureus dan Escherichia coli)

Disusun oleh :

NISA KAMILIA ELSANDRA

NPM : 411117128

PROGRAM STUDI ANALIS KESEHATAN (D-3)

STIKES JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI

2018/2019
A. TANGGAL PRAKTIKUM
Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi STIKES
Jenderal Achmad Yani Cimahi pada tanggal 14, 15, dan 16 Mei 2019.

B. TEORI DASAR

1. Identifikasi

Identifikasi dan determinasi suatu biakkan murni bakteri yang telah

diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan melalui pengamatan ciri-ciri
morfologi koloni tersebut serta pengujian fisiologi dan biokimianya. Bakteri
dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia tersebut . Dengan
menananm bakteri pada medium, maka akan diketahu sifat suatu koloni
bakteri. Sifat metabolism bakteri dalam uji biokimia dapat dilihat dari
interaksi metabolit-metabolitt yang dihasilkan dengan reagen kimia yang
digunakan (Waluyo, 2007).
Dalam mengidentifikasi suatu bakteri dapat dilakukan dengan
mengamati karakteristik makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia bakteri
tersebut. Karakteristik makroskopis yang dapat diamati meliputi bentuk
koloni yaitu berbentuk titik, bulat, tidak teratur, seperti akar, dan filamen
atau berbenang, serta kumparan. Tepi koloninya dapat berbentuk utuh,
berombak, berbelah, bergerigi, berbenang, dan keriting. Warna koloni
terdiri dari keputihan, kekuningan, kemerahan, cokelat, jingga, orange,
pink, hijau, dan ungu. Elevasi koloni meliputi rata, timbul datar,
melengkung, dan cembung. Struktur koloninya halus mengkilat, kasar,
berkerut, atau kering seperti bubuk. Selain itu, ukurannya pun beragam
dapat dilakukan dengan mengukur diameter dari koloni bakteri yang
tumbuh (Irianto, 2012).
Karakteristik mikroskopis yang dapat diamati meliputi bentuk sel,
ukuran sel, dan pewarnaan. Bentuk sel seperti bentuk batang (basil), bulat
(kokus), dan spiral dengan masing-masing kombinasinya. Pengukuran sel
bakteri secara mikroskopis dapat dilakukan dengan micrometer. Serta
pewarnaan yang dilakukan meliputi pewarnaan Gram dan pewarnaan
endospore (Cappuccino & Sherman, 1987).
 Identifikasi morfologi bakteri dapat diteliti melalui teknik pewarnaan.
Salah satu teknik pewarnaan adalah pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram
termasuk ke dalam pewarnaan diferensial karena dapat membagi
kelompok bakteri Gram positif dan Gram negatif. Pembagian golongan
tersebut berdasarkan reaksi dinding sel bakteri terhadap pewarna krisal
violet dan safranin. Bakteri Gram positif memiliki peptidoglikan yang tebal
pada dinding selnya sehingga saat diwarnai sel akan berwarna ungu.
Sedangkan bakteri Gram negatif memiliki kandungan lipid yang tebal pada
dinding selnya sehingga ketika diwarnai dengan kristal violet lalu dibilas
dengan alkohol, lipid akan larut dan ikut terbilas sehingga bakteri Gram
negatif akan menyerap pewarnaan kedua yaitu merah (James et al 2002).
Uji biokimia dilakukan untuk mengetahui karakteristik dan spesifik
dari bakteri dengan melihat aktifitas enzimatiknya, serta memperkuat data-
data yang diperoleh sehingga mudah diidentifikasi. Beberapa uji biokimia
yang diterapkan antara lain uji produksi indol, uji fermentasi karbohidrat, uji
penggunaan sitrat, uji methyl red, uji voges proskauer, uji urease, katalase,
dan uji H2S (Cappuccino & Sherman, 1987).

2. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat

warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop. Disisi lain, bakteri gram-
negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan keduanya
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda dan dapat
dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini ditemukan pada
tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian Gram dan
merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri.
Bakteri gram positif seperti Staphylococcus aureus (bakteri patogen
yang umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal
yang dikelilingi dinding sel tebal berupa peptidoglikan. Sekitar 90% dari
dinding sel tersebut tersusun atas peptidoglikan sedangkan sisanya berupa
molekul lain bernama asam teikhoat. Di sisi lain, bakteri gram negatif
(seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda di mana membran
pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai
dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran
dalam dan membran luarnya.
Ciri-ciri bakteri Gram positif
 Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
 Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama
merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
 Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
 Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu
kristal.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
 Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
 Tidak peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk berupa eksotoksin dan endotoksin
Bakteri dapat berkembang di berbagai media. Salah satunya
adalah media agar darah. Agar darah dapat dibuat dari Tryptic Soy Agar
dengan darah domba 5% atau bisa juga darah kelinci. Media agar darah
dapat menjadi media pertumbuhan bakteri untuk dilihat reaksi
hemolitiknya. Cara membaca reaksi hemolitik pada media agar darah yaitu
cawan petri harus diangkat ke sumber cahaya dan diamati dengan cahaya
yang datang dari belakang (Buxton 2013).
Terdapat tiga jenis hemolisis yaitu beta hemolisi, alpha hemolisis,
dan gamma hemolisis. Beta hemolisis adalah hemolisis total (seluruh sel
darah merah lisis) maka tampak zona yang jelas, mendekati warna dan
transparasi media dasar, mengelilingi koloni. Alpha hemolisis adalah
hemolisis sebagian (penurunan hemoglobin sel) maka menyebabkan
perubahan warna hijau atau coklat dalam medium. Gamma hemolisis
adalah tidak terjadi hemolisis sama sekali (Buxton 2013).
Uji katalase penting untuk membedakan streptococcus (katalase
negatif) dengan staphylococcus yang menghasilkan enzim katalase
(katalase positif). Uji katalase dilakukan dengan menambahkan H2O2 3%
ke isolat bakteri. Kultur yang menunjukkan katalase positif akan
gelembung udara.
Bakteri dapat memproduksi enzim katalase yang dapat memecah
H2O2 menjadi H2O dan O2. Uji katalase digunakan untuk mengetahui
aktivitas katalase pada bakteri uji. Enzim ini penting untuk pertumbuhan
aerobik karena H2O2 yang dibentuk oleh enzim pernafasan bersifat racun
terhadap sel mikroba. Beberapa bakteri yang termasuk katalase negatif
adalah Streptococcus, Lactobacillus, Clostridium, dan Leuconostoc.
Beberapa bakteri diantaranya memproduksi katalase lebih banyak
daripada yang lain. Ini ditunjukkan dengan jumlah yang banyak pada
bakteri aerob. Sedangkan enzim tidak diproduksi oleh bakteri anaerob
obligat karena mereka tidak memerlukan enzim tersebut.
Manitol Salt Agar (MSA) merupakan media pertumbuhan khusus
bakteri halophilik dan dapat membedakan Staphylococcus patogen dan
non patogen. Media ini mengandung konsentrasi NaCl yang tinggi yaitu
7,5%. Kebanyakan bakteri tidak dapat bertahan hidup di lingkungan yang
memiliki kadar sangat tinggi. Namun, genus Staphylococcus dapat
tumbuh pada media ini. Selain Staphylococcus, bakteri Streptococcus
juga masih dapat tumbuh.
MSA mengandung manitol dan indikator PH phenol red. Hal ini
menyebabkan media MSA menjadi media diferensial. Bakteri
Staphylococcus aureus akan menghasilkan warna media/ koloni kuning
karena dapat memfermentasi manitol menjadi asam yang kemudian
merubah warna indikator phenol red dari merah menjadi kuning.
Staphylococcus jenis lainnya menghasilkan koloni merah muda atau
koloni merah dengan tidak ada perubahan warna medium karena tidak
dapat memfermentasi manitol (Sari 2003).
Prinsip uji koagulase yaitu fibrinogen pada plasma kelinci diubah
menjadi fibrin oleh koagulase. Koagulase merupakan protein ekstraseluler
yang mengikat prothrombin hospes dan membentuk komplek yang disebut
staphylothrombin. Hasil reaksi positif ditandai dengan terbentuknya
gumpalan di dalam tabung setelah diinkubasi dalam suhu 370c selama 24
jam (quinn dkk, 2002).
3. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan

zat warna kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan
berwarna merah bila diamati dengan mikroskop.
Disisi lain, bakteri gram-positif akan berwarna ungu. Perbedaan
keduanya didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel yang berbeda
dan dapat dinyatakan oleh prosedur pewarnaan Gram. Prosedur ini
ditemukan pada tahun 1884 oleh ilmuwan Denmark bernama Christian
Gram dan merupakan prosedur penting dalam klasifikasi bakteri.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang
berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini
umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-
negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau
endotoksin).
Ciri-ciri Bakteri Gram Negatif
 Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau
multilayer.
 Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%),
peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan
jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
 Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
 Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya
kristal violet.
 Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
 Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
 Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
 Peka terhadap streptomisin
 Toksin yang dibentuk Endotoksin
Salah satu dari bakteri Gram negative adalah Escherichia coli.
Bakteri ini merupakan salah satu anggota famili Enterobacteriaceae yang
sering menimbulkan penyakit diare. Bakteri ini ditemukan oleh Theodor
Escherich pada tahun 1885. Secara garis besar
klasifikasi bakteri Escherichia coli berasal dari filum Proteobacteria, Kelas
Gamma Proteobacteria, Ordo Enterobacteriales, Familia
Enterobacteriaceae, Spesies Escherichia coli (Munif, 2009).
Escherichia coli biasanya berkolonisasi di saluran pencernaan
dalam beberapa jam setelah masuk ke dalam tubuh dan membangun
hubungan mutualistik. Namun, strain non patogenik dari Escherichia coli
bisa menjadi patogen, ketika adanya gangguan di dalam pencernaan serta
imunosupresi pada host (Sanz-Garcia et al., 2009; Sharma et al., 2011;
Janny et al., 2012).
Escherichia coli adalah anggota flora normal usus. Escherichia coli
berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen
empedu, asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan.
Escherichia coli termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang memperoleh
makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena tidak dapat
menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh
dari sisa organisme lain. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam
makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi, dan mineral. Di
dalam lingkungan, bakteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan
penyedia nutrisi bagi tumbuhan (Sri, 2010).
Escherichia coli merupakan bakteri yang rentan terhadap suhu tinggi.
Escherichia coli mempunyai suhu maksimum pertumbuhan 40 - 45°C, di
atas suhu tersebut bakteri Escherichia coli mengalami inaktivasi
(Hawa,2011)
a. Morfologi
Escherichia coli berbentuk batang pendek 0,5 µm x 13 µm,
batang bervariasi dari coccoid bipoler hingga filament panjang,
biasanya terletak sendiri-sendiri atau rantai pendek. Tidak membentuk
spora. Biasanya dapat bergerak dengan flagella peritrich, tetapi
beberapa strain tidak memiliki flagella. Bakteri ini mudah diwarnai
dengan zat warna biasa (Rosilawati dkk, 2011).
b. Sifat Sifat Biakan
Escherichia coli bersifat aerob dan fakultatif anaerob pada
perbenihan yang mengandung karbohidrat yang dapat diuraikannya.
Pertumbuhan Escherichia coli bisa pada suhu 15-450C dan paling baik
pada 37,50C. Tumbuh pada pH 7 dan pada media biasa. Pada plat
 agar, koloni berwarna putih kekuningan atau kuning keemasan sesuai
dengan umur pupukan, basah mengkilat, lembut dan bulat dengan isi
yang rata. Pada media cair membentuk kekruhan yang merata dan
membentuk deimen yang pekat. Untuk identifikasi Escherichia coli
menggunakan eosin methylinre blue agar. Pada medium ini koloni
membentuk pusat yang kehitam-hitaman seperti metalik (Rosilawati
dkk, 2011).
c. Reaksi biokimia
Escherichia coli membentuk asam dan gas dari glukosa,
laktosa, fruktosa, galaktosa, arabinosa, xylosa, ramnosa, dan manitol,
kadangkdang dapat mengurai sukrosa, rafinosa, salisin, eskulin,
dulsitol, dan gliserol. Jarang mengurai pectin dan adonitol, tidak
mengurai dekstrin, pati, glikogen dan inositol. Methyl red test positif,
voges Preskauer negative, kalatase postif, tidak mencerna atau
mencairkan gelatin, indol positif, mereduksi nitrat, mengkoagulasikan
serta mengasamkan susu tanpa peptonasi, mengoksidasi kentang
menjadi warna coklat tua dan tidak membentuk H2S (Rosilawati dkk,
2011). Escherichia coli biasanya mati pada temperatur 600C selama 30
menit, tetapi ada juga strain yang resisten. Beberapa Escherichia coli
dapat hidup dalam es pada suhu pembekuan hingga 6 bulan, 95% sel
bakteri dapat mati selama 2 jam pada suhu pembekuan. Bakteri
Escherichia coli cepat terbunuh oleh kekeringan dan oleh desinfektan
biasa (Rosilawati dkk, 2011).
d. Struktur Antigen dan Toksin
Ada 3 (tiga) antigen Escherichai coli, yaitu O, K, dan H antigen.
Organisme ini tidak membentuk toksin (Rosilawati dkk, 2011).
e. Patogenitas
Escherchia coli merupakan salah satu penyebab penyakit yang
dapat menyerang unggas pada berbagai tingkatan umur dengan
mortalitas yang tinggi. Kematian anak ayam dapat terjadi sampai umur
3 minggu dengan gejala omphalitis, oedema, jaringan disekitar pusar
menjadi lembek seperti bubur. Pada ayam dapat menyebabkna
bentukan-bentukan granuloma like di sepanjang traktus intestinalis
 yang disebabkan oleh Escherichia coli berkapsul dan penyakitnya di
sebut Hjarre’s disease atau juga coli granuloma (Rosilawati dkk, 2011).

C. TUJUAN PRAKTIKUM
Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri campuran Gram positif
dan Gram negatif pada sampel No.1

D. ALAT DAN BAHAN

1. Alat
Tabel 1. Alat yang Digunakan Praktikum

No Alat Spesifikasi Jumlah

1. Tabung Reaksi Kecil dan Besar 12

2. Rak Tabung Ø 1cm 12 lubang 1

3. Lampu Spirtus - 1

4. Ose Bulat&Tusuk Kawat NiCr 1

5. Objek Glas - 2

6. Mikroskop - 1

7. Tabung Durham Kecil 6

8. Cawan Petri Ø 15 cm 4

2. Bahan
Tabel 2. Bahan yang Digunakan Praktikum

No Nama Bahan Spesifikasi

1. Sampel Suspense No.1

2. Media Agar Mac Conkey Agar

Agar Darah
a. Mannitol Salt Agar

3. Media uji gula - gula

  Glukosa 1%
 Laktosa 1%
 Sukrosa 1%
Manitol a. 1%

4. Media uji biokimia

 MR Methyl Red
 VP Alfa naftol dan KOH 40%
-
 TSIA -
 Simon Citrate -
 Urease Kovaks
SIM

5. Pewarnaan Gram Larutan Kristal Violet

Lugol
Safranin

6. Alkohol 70 %
96%

7. Akuades -

8. Minyak Imersi -

9. H2O2 -

E. PROSEDUR KERJA

Pada hari pertama, dilakukan penanaman dari sampel suspense no1

ke media MCA,MSA,dan AD. Sampel tersebut ditanamkan dengan
menggunakan ose bulat yang sudah steril. Sampel diambil sebanyak satu ose
lalu dibuat goresan empat kuadran pada media tersebut. Cawan yang sudah
ditanami sample diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37℃.
Pada hari kedua, dilakukan pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri
pada semua media. Koloni yang tumbuh tersebut diambil sebanyak 1 ose dari
Media MCA dan dari MSA, kemudian dilakukan pewarnaan Gram. Koloni
yang diambil ditambahkan dengan NaCl steril lalu dioleskan ke objek glass
yang kering dan bersih dan dilakukan fiksasi. Preparat yang sudah difikasasi
kemudian dituangi larutan kristal violet selama 1 menit. Lalu, dicuci dengan
air mengalir. Tahap berikutnya preparat dituangi larutan Lugol selama 1 menit,
kemudian dicuci dengan air mengalir.Kemudian, penambahan alkohol 96 %
selama 20-30 detik, lalu penambahan safranin selama 20-30 detik. Preparat
pewarnaan Gram diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran total 1000x
menggunakan minyak imersi.
Proses berikutnya diinokulasikan 1 koloni bakteri dari Media MCA untuk
bakteri gram negative batang kedalam berbagai macam media gula –gula dan
biokimia. Media gula-gula diantaranya Laktosa, manitol, sukrosa, dan
glukosa. Media uji biokimia diantaranya MR, VP, urease, TSIA, Simon Citrate,
dan SIM. Sedangkan untuk bakteri Gram positif diambil dari koloni yang
tumbuh pada MSA hanya ditanam pada gula glukosa dan sukrosa kemudian
membuat Mac Farland untuk uji resistensi antibiotic novobiosin,dan dari koloni
AD diambil 1 ose koloni yang mirip dengan tersangka gram positif dan
dilakukan uji plasma koagulase. Semua media tersebut diinkubasi pada suhu
37℃ selama 24 jam didalam inkubator.
Pada hari ketiga, dilakukan pengamatan yang terjadi pada media gula
– gula dan media uji biokimia. Pada media MR dilakukan penambahan Methyl
red sebanyak 5 tetes dan amati perubahan yang terjadi. Pada media VP
dilakukan penambahan alfa naftol 4 tetes dan KOH 10% 1 tetes kocok tunggu
5 menit lalu diamati adanya perubahan. Pada media SIM dilakukan
penambahan reagen Kovaks 1-2 tetes lalu dibiarkan selama 1-2 menit dan
amati adanya perubahan.
F. HASIL PENGAMATAN

Hari Kedua Tabel 3. Pengamatan pada Media

Kriteria MCA AD MSA

Bentuk Koloni Bulat Bulat Bulat

Warna koloni Pink Putih keabuan kuning

Elevasi Cembung Cembung Cembung

Pinggiran Rata Rata Rata

Ciri khas lain Fermenter ß Hemolisis Fermenter

laktosa manitol

Metode:Pewarnaan Gram

Bentuk : basil

Susunan : monobasil

Sifat : Gram negatif

Warna : Merah

Perbesaran : 1000x
 Metode:Pewarnaan Gram

Bentuk : Coccus

Susunan: Staphylococcus

Sifat : Gram positif

Warna : Ungu

Perbesaran : 1000x

Hari Ketiga Tabel 4. Hasil Uji biokimia

No Nama Uji Sebelum Sesudah Hasil

1. Glukosa Ungu Kuning F(+)/G(+)

2. Sukrosa Ungu Kuning F(+)/G(+)
3. Manitol Ungu Kuning F(+)/G(+)
4, Laktosa Ungu Kuning F(+)/G(+)
5.
SIM Hitam
 Sulfur Kuning jernih Tidak ada Negatif (-)
 Indol Kuning jernih perubhan Positif(+)
 Motilitas Kuning jernih Keruh , Positif (+)
menyebar
6. TSIA
 Lereng Merah Kuning Asam
 Dasar Merah Kuning Asam
 Sulfur Merah Kuning Negatif (-)
 Gas Tidak ada Tidak ada Gas(+)
7. Keruh, terbentuk
MR Jernih Positif (+)
cincin merah
 8. Keruh,tidak
VP Jernih terbentuk cincin Negatif (-)
merah
9. Urease Kuning Kuning Negatif (-)
10. Simon Citrate Hijau Hijau Negatif (-)
Hasil uji biokimia pada Gram positif

 Katalase : Positif
 Plasma koagulase : Positif
 Antiobiotik novobiosin : Resisten
 Glukosa : Fermenter
 Sukrosa : fermenter

G. PEMBAHASAN

Pada hasil penanaman di media Agar darah dan MSA pada hari
pertama didapatkan koloni mengarah pada bakteri S. aureus . Untuk di agar
darah koloninya berukuran besar, berbentuk bulat, permukaannya licin, tepi
koloni rata, warna koloni krem/ putih dan β hemolisis ditandai dengan
terbentuknya zona transparan. Perbedaan jenis hemolisis disebabkan oleh
produksi oksigen ketika pertumbuhan. Pada uji katalase pada koloni yang
mengarah pada bakteri S. aureus dapat menghasilkan gelembung-
gelembung oksigen karena adanya pemecahan H2O2 oleh enzim katalase
yang dihasilkan oleh bakteri itu sendiri sehingga bakteri ini termasuk ke dalam
bakteri katalase positif. Komponen H2O2 ini merupakan salah satu hasil
respirasi aerobik bakteri, dimana hasil respirasi tersebut justru dapat
menghambat pertumbuhan bakteri karena bersifat toksik.
Mekanisme enzim katalase memecah H2O2 yaitu saat melakukan
respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya
H2O2. Dengan enzim katalase, H2O2 diurai dengan reaksi sebagai berikut :
2 H2O2. 2H2O + O2
Staphylococcus dapat bersifat fermenter mannitol dan nonfermenter
manitol. Cara membedakan sifat tersebut salah satunya dengan pembiakan
koloni tersangka Staphylococcus pada media Manitol Salt Agar (MSA). Hasil
positif ditandai oleh warna media yang berubah menjadi kuning sehingga
koloni juga berwarna kuning. Hal ini menandakan bakteri S. aureus adalah
bakteri yang dapat memfermentasikan manitol. Sebaliknya hasil negtif
ditandai dengan tidak berubahnya warna media, tetap merah. Hal ini
menandakan bakteri S. epidermidis adalah bakteri nonfermenter manitol.
Pada koloni yang mengarah ke Staphylococcus dapat bersifat patogen
dan kurang patogen/ non patogen. Cara membedakan sifat tersebut dapat
melalui uji koagulase. Prinsip uji ini adalah terjadi/ tidak terjadinya
penggumpalan plasma darah (plasma darah kelinci) setelah ditambahkan
isolat biakan bakteri. Penggumpalan terjadi pada plasma darah yang
ditambahkan isolat bakteri S. aureus sehingga uji koagulase positif untuk S.
aureus. Hasil positif ini menandakan bahwa bakteri S. aureus adalah bakteri
patogen. Hasil negatif terjadi pada bakteri S. epidermidis karena plasma
darah tetap cair sesudah ditambahkan isolat bakteri.
Pada uji biokimia didapatkan hasil fermenter sukrosa dan glukosa.
Serta pada uji resistensi didapatkan hasil resisten terhadap antibiotic
novobiosin hal ini dinyatakan resisten karena zona hambatnya < 14 mm.
Seharusnya jika bakteri ini mengarah pada S. aureus hal ini dapat terjadi
karena pada saat pembuatan suspense bakteri 0,5 MC Farland menggunakan
koloni pada Agar Darah yang kemungkinan terkontaminasi dengan bakteri
lain lebih memungkinkan , berbeda halnya bila diambil dari koloni yang
terdapat pada media MSA karena media MSA merupakan medium selektif
untuk golongan Staphylococcus dan differensial terhadap Staphyloccocus
yang dapat memfermentasikan mannitol dan nonfermenter mannitol.
Selanjutnya pada koloni di MAC yang merupakan hasi isolasi dari hari
pertama dilakukan penanaman sampel No.1 pada media Mac Conkey agar
dengan teknik isolasi strik 4 kuadran. Kemudian di inkubasi pada suhu 370C
selama 24 jam. Pada hari selanjutnya diamati dan diidentifikasi pada media
Mac Conkey agar bahwa Escherichia coli memiliki ciri memfermentasi lakotas
pada Mac Conkey agar sehingga tetap berwarna merah dan koloni berwarna
pink, dengan ukuran 1-2 mm, berbentuk bulat, eleveasi cembung, pinggiran
rata, permukaan basah. Pada koloni yang terpisah dan menjadi tersangka
Escherichia coli dilakukan pewarnaan Gram. Dari hasil pewarnaan Gram
didapatkan bakteri berwarna merah yang dapat dinyatakan bersifat Gram
Negatif (-) berbentuk batang (basil) dengan susunan monobasil.
 Setelah dilakukan pewarnaan Gram , dilakukan inokulasi pada media
uji biokimia bakteri pada koloni tersangka. Uji biokimia yang dilakukan
diantaranya yaitu uji sitrat (media Simmon’s Citrate), uji urease, uji sulfur, uji
indol, uji motilitas, uji pada media TSIA, uji gula-gula, uji MR, dan uji VP.
Kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
Pada hari selanjutnya dilakukan pengamatan hasil uji biokimia
tersebut, pada uji gula-gula yaitu glukosa, laktosa, mannitol, dan sukrosa,
bakteri ini dapat memfermentasi ke-4 media gula-gula tersebut dengan
terlihatnya perubahan warna dari ungu menjadi kuning dan terdapat gas pada
tabung durham. Pada uji sitrat menggunakan media SC tidak terjadi
perubahan warna yang menandakan bahwa bakteri ini tidak dapat
menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya. Pada uji urease tidak terjadi
perubahan warna karena pHnya asam sehingga tetap kuning hal ini
disebabkan bakteri tersangka tidak memiliki enzim urease yang dapat
menghasilkan amoniak yang menyebabkan perubahan warna menjadi pink
dikarenakan pHnya menjadi basa hal ini dibantu dengan indikator phenol red
yang terdapat pada media uji urease. Pada media SIM dialkukan uji sulfur,
indol, dan motilitas. Hasil yang didapatkan pada media tersebut yaitu tidak
ada terbentuk warna hitam yang menandakan tidak adanya membentuk gas
sulfur, dan terdapat zona pergerakan sperti akar pada daerah sekitar
penusukan dan terdapat seperti awan pada atas media sehingga motilitas
dapat dinyatakan positif, indol dinyatakan positif (+) karena terdapatnya cincin
ungu pada bagian atas media , hal ini menandakan bahwa bakteri ini
mempunyai enzim triptopanase yang mengoksidasi asam amino triptopan
membentuk indol. Pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) sesuai dengan
nama medianya yaitu mengandung 3 jenis karbohidrat yaitu pada lereng
terdapat glukosa dan pada dasar terdapat laktosa dan sukrosa, dengan
bantuan indikator phenol red maka dapat dibedakan yang dapat
memfermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa. Pada hasil uji didapatkan
warna kuning/kuning yang menandakan dapat memfermentasi ke-3
karbohidrat tersebut dengan sifat Asam/Asam. Sesuai dengan nama media
TSIA mengandung iron atau besi sebagai pendeteksi adanya gas H2S yang
kemudian akan membentuk warna hitam karena reaksi 𝐻2 𝑆 + 𝐹𝑒 2+ → 𝐹𝑒𝑆 dan
media ini mengadung sulfur sebagai salah satu sumber karbon namun tidak
digunakan oleh bakteri tersebut, dapat dilihat bahwa media tidak berwarna
hitam. Hasil pada TSIA dan gula-gula dapat disesuaikan karena komposisi
TSIA terdapat 3 jenis karbohidrat yang di ujikan pula pada uji gula-gula.
Pada uji MR didapatkan warna merah pada media pepton yang telah
diinkubasi setelah ditambahkan methyl red 1% hal ini menandakan bahwa
bakteri dapat memfermentasikan dan menghasilkan asam campuran
(metilenglikon) yang dapat menyebabkan berwarna merah. Pada uji VP tidak
didapatkan perubahan setelah ditambahkan -naphtol 5% dan KOH 40%, hal
ini menandakan tidak menghasilkan asetil karbinol (asetoin) dari hasil
fermentasi glukosa sehnigga tidak menyebabkan perubahan warna/ tidak
menjadi merah.
Tabel 5. Derajat Kemiripan
Uji Biokimia Hasil Praktikum Escherichia coli

Glukosa F(+),G(+) F(+),G(+)

Sukrosa F(+),G(+) F(+),G(+)

Manitol F(+),G(+) F(+),G(+)

F(+),G(+)
Laktosa F(+),G(+)

MR + +

VP - -

UREASE - -

SC - -

SULFUR - -

INDOL + +

MOTIL + +
TSIA :
A/A A/A
 Lereng/Dasar
 SULFUR - -

 GAS + +

rumus: Hasil pengamatan / Jumlah parameter x 100%

didapatkan Hasil Perhitungan dari sample urin adalah :

14
 x 100% = 100% mengarah pada bakteri Escherichia coli
14

Parameter Hasil Staphylococc Staphylococcu Staphylococcu

uji us aureus s epidermidis s saprophiticus

Glukosa Fermenter Fermenter Fermenter Fermenter

Sukrosa Fermenter fermenter Fermenter Non fermenter

Katalase + + + +

Plasma + + - -
koagulase

Uji Resisten Sensitif Sensitif Resisten

novobiosin

Sifat ß ß hemolysis Hemolysis/unhe Unhemolisis

hemolysis hemolysis molisis
pada AD

rumus: Hasil pengamatan / Jumlah parameter x 100%

didapatkan Hasil Perhitungan dari sample adalah :

5
 x 100% = 83% mengarah pada bakteri Staphylococcus aureus
6
4
 6
x 100% = 66% mengarah pada bakteri Staphylococcus epidermidis
3
 6
x 100% = 50% mengarah pada bakteri Staphylococcus saprophyticus
H. KESIMPULAN

Dari hasil praktikum isolasi dan identifikasi bakteri campuran pada

sampel no1 didapat hasil bakteri Gram negatif mengarah pada bakteri
Escherichia coli dengan derajat kemiripan 100%, dan bakteri Gram positif
mengarah pada bakteri Staphylococcus aureus dengan derajat kemiripan
83%.

I. DAFTAR PUSTAKA

Alam, M.S, Sarjono P.R, Aminin, A.L.N. 2013. Isolasi Bakteri Selulolitik
Termofilik Kompos Pertanian Desa Bayat, Klaten, Jawa Tengah. Chem
Info. No.1(1) : 190-195.
Arifin, Munif. 2009. “Jarak Aman antara Septic Tank dengan Sumur Gali”
(online), http://environmentalsanitation.wordpress.com/ category/jarak-
septic-tank/, diakses tanggal 17 Maret 2019) _____________. 2012.
“Angka Kuman Peralatan Makanan” (online),
(http://helpingpeopleideas.com/publichealth/index.php/2012/02/angka-
kuman -peralatan-makanan/, diakses 17 Maret 2019)
Buxton R. 2013. Blood Agar Plates and Hemolysis Protocols. [Internet]
[diakses 2015 November 18]. Tersedia pada: http://microbelibraby.org
Cappuccino, J.G. & N. Sherman. 1987. Microbiologyu A Laboratory Manual.
California : The Benjamin/Cummings Publishing Company.
Elfita, Muharni, Munawar, Salni, dan Ade Oktasari. 2010. Senyawa
Antimalaria dari Jamur Endofitik Tumbuhan Sambiloto (Andographis
paniculata Nees). Jurnal Natur Indonesia. No.13(2) : 123-129.
Hawa, L.C., Susilo, Bambang., Jayasari, N.E. 2011. Studi Komparasi
Inaktivasi Escherichia coli Dan Perubahan Sifat Fisik Pada Pasteurisasi
Susu Sapi Segar menggunakan Metode Pemanasan Dan Tanpa
Pemanasan Dengan Kejut Medan Listrik. Jurnal Keteknikan Pertanian,
Universitas Brawijaya ,Malang. P. 34.
Irianto, K. 2012. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikrooganisme Jilid I. Bandung:
Yrama Widya
Irnaningtyas. 2013. Biologi untuk SMA/MA Kelas X. Jakarta: Erlangga.
James J, Baker C, Swain H. 2002. Principles of Science for Nurses.
Jakarta(ID): Erlangga.

Kusuma, Sri Agung Fitri. 2010. Escherichia coli. Universitas Padjadjaran

Fakultas Farmasi. Bandung.
http://pustaka.unpad.ac.id/wpcontent/uploads/2011/09/pustaka_unpad
_Escherichi a-coli.pdf. ( diakses tanggal 17 maret 2019)
Krisno, 2011. Peranan Mikroba. http://krisnoplames.blogspot.com/peranan-
mikroba.html. Diakses pada tanggal 17 Maret 2019.
Muliawan, S. 2008. Bakteri Spiral Patogen. Jakarta: Erlangga.
Quinn, P. J., B. K. Markey, M. E. Carter, W. J. Donnelly and F. C. Leonard.
2002. Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Blackwell
Publishing. USA.

Rosilawati Erni, R. Ratnasari, H.E. Narumi, Suryani, W. Tyasnigsih, S.

Chusniati.2011. Mikrobiologi Veteriner I. AUP Unair. Surabaya
Sanz-Garcia, M., Fernandez-Crus, A., Rodriquez-Creixems, M., Cercenado,
E., Marin, M., Munoz, P., and Bouza, E. 2009. Recurrent Escherichia
coli Bloodstream Infection: Epidemiology and Risk Factors. Medicine
(Baltimore), 88(2): 77 – 82.

Sari, R. W. 2003. Pengaruh Pemberian Gerusan Daun Sirih Hitam, Gerusan

Daun Sirih Jawa dan Oksitetrasiklin Secara Topikal Terhadap Lama
dan Waktu Kesembuhan Luka Infeksi Staphylococcus aureus pada
Tikus Putih. [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas
Airlangga. Surabaya.

Subronto. 2003. Ilmu Penyakit Ternak (Mamalia) I. Edisi Kedua. Gadjah Mada
University Press. Yogyakarta.

Tamher, S. 2008. Mikrobiologi Untuk Mahasiswa Keperawatan. Jakarta:

Trans Info Media.
Waluyo, L. 2007a. Mikrobiologi Umum. Malang : Universitas Muhammadiyah
Malang Press.
Waluyo, L. 2007b. Mikrobiologi Lingkungan. Malang : Universitas
Muhammadiyah Malang Press.
J. Lampiran

Dokumentasi hasil praktikum sampel urin

Sebelum ditanam Sesudah ditanam

Media MCA Media MCA

Media MSA
Media AD sudah
ditanam

Media SIM Sulfur (-)

Indol (+)

Motilitas (+)

Manitol : F(+)/G(+)

Glukosa : F(+)/G(+)

Laktosa : F(+)/G(+)

Sukrosa : F(+)/G(+)

Gula- Gula
 Uji Vp

Uji Vp(-)

Uji MR

MR(+)

TSIA Lereng : Kuning (asam)

Dasar : Kuning (asam)

Gas : Positif

Sulfur : negatif

Urease Urease (-)

Simon Citrate Sitrat (-)

Uji Katalase positif

Uji Koagulase positif

Pembimbing Praktikum, Praktikan,

.......................................... Nisa Kamilia Elsandra

(411117128)