BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil
sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga
organism mikroskopik. Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler)
maupun bersel banyak (multiseluler). Mikroorganisme yang hidup di alam memiliki
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri
tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal
ini juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu untuk mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut
diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-
1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan
antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana, 2008).
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil
ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan
berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri
gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau
kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri
gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang membuat
semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian
tersebut berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan
perbedaan struktur dinding sel mereka (Karmana 2008).

1.2. Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah:
1. Membedakan jenis bakteri gram positif dan gram negatif
2. Mempermudah melihat mikroba di bawah mikroskop
3. Memperjelas bentuk dan ukuran mikroba
4. Mengetahui struktur bagian dalam mikroba.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil,

bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang
beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel
spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1
sampai 0,3 µm. (Pelczar dan Chan, 2007).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam.
Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai
stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung
dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit,
karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 1998).
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk
membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana,
2008).
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negatif, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet.
Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureas, sedangkan bakteri gram negatif misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa
bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium sp, karena
dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan
asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaantersebut sel bakteri akan berwarna
merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut
kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang
berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih
banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran
sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa
akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih
jelas terlihat. Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan
untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai
latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak
dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala
zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif,
perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat
berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan (Dwidjoseputro,
2005).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut
pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa
yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya
pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk
meningkatkan kontras dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan
mencakup penyiapan mikroorganisme dengan melakukan preparat ulas
(Dwidjoseputro, 2005).
Prinsip dalam pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat
warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif
terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat,
sedangkan bakteri Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-
porinya mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol
(Fardiaz, 1989).
Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk
membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif,
 Dalam taksonomi mikroba alat yang paling ampuh digunakan yaitu Gram
Stain yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria
ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif
banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit
dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram
negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid.
Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit,spesies gram negatif umumnya
lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif. Lipopolisakarida yang
terdapat pada dinding sel bakteri gram negatif sering bersifat toksik (racun), dan
membran bagian luar membantu melindungi bakteri gram-negatif patogen melawan
sistem pertahanan inangnya. Bakteri gram negatif umumnya lebih resisten terhadap
antibiotik dibandingkan dengan gram-positif karena membran bagian luar itu
mengahalangi masuknya obat-obatan (Campbell, 2003).
Bakteri Gram Positif adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan
lapisan peptidoglikan yang tebal. Bakteri ini akan berwarna ungu jika diwarnai
dengan pewarnaan Gram. Contohnya Neisseria gonnorrhoaeae, Treponema
pallidum, Vibrio Cholerae dan Bacillus subtilis. Sedangkan Bakteri Gram Negatif
adalah bakteri yang memiliki dinding sel dengan lapisan peptidoglikan yang tipis.
Bakteri ini akan berwarna merah muda atau merah, kila diwarnai dengan pewarnaan
gram. Contohnya Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus dan Escherichia coli
(Aryulina, 2004).
Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar
yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan
penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami
kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini
menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini
berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat
memertahankan kristal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,
1994).
 BAB III
PELAKSANAAN PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada Senin, 06 Maret 2017, bertempat di Laboratorium
Teaching 3, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Andalas.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Adapun alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu mikroskop, cover glass, kaca
objek, gelas objek, jarum ose, dan bunsen.
3.2.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada pewarnaan gram ini yaitu sampel bakteri (E. Coli
dan Bacillus), kristal violet, lugol, alkohol 96%, aquades, dan safranin.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Cara Kerja
1. Preparat disterilkan dnegan alkohol 96%
2. Ose dipijarkan, lalu diambil bakteri secukupnya, kemudian diletakkan di
preparat
3. Diteteskan kristal violet sebanyak 2-3 tetes, didiamkan, lalu ditunggu
hingga 1 menit
4. Setelah 1 menit, preparat dibersihkan dengan cara fiksasi (pengaliran) oleh
aquadest pada permukaan preparat.
5. Kemudian diteteskan lugol, diamkan dan ditunggu hingga 1 menit
6. Dilakukan fiksasi kembali oleh aquadest, lalu diteteskan dengan alkolhol
7. Didiamkan hingga 30 detik
8. Preparat dicuci dengan air mengalir, kemudian diteteskan safranin
sebanyak 1-2 tetes, lalu dikering-anginkan
9. Setelah kering, sampel diamati di bawah mikroskop.
3.3.2 Skema Kerja
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Adapun hasil yang diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
No Teknik Pewarnaan Pengamatan

1. Pewarnaan Gram Keterangan:

Perbesaran 400
Berwarna merah
Berbentuk basil

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini, dilakukan pewarnaan gram pada bakteri yang diberkan
guna mengetahui jenis dan karakter dari bakteri tersebut. Proses pewarnaan gram
adalah cara yang digunakan untuk mrengetahui ukuran dan bentuk bakteri, struktur
luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. (Pelczar & Chan, 2007).
Bakteri yang terwarnai dengan cara ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu
bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat
pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna
tandingannya yaitu dengan zat pewarna safranin akan tampak berwarna merah.
Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding
selnya, dimana dinding Gram Positif mengandung banyak peptidoglikan, sedangkan
dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung lipopolisakarida (Suriawiria,
2005).
Setalah melalui proses pemberian kristal violet, lugol, alkohol, dan safranin
pada bakteri yang diamati selama praktikum berlangsung, dapat diindentifikasi
bahwa jenis bakteri yang diberikan adalah bakteri gram negatif., ditandai dengan
bakteri yang menujukkan warna merah saat diamati di bawah mikroskop. Bakteri ini
disebut bakteri gram negatif karena dinding sel pada bakteri gram negatif sedikit
mengandung peptidoglikan, sehingga tidak dapat mempertahankan warnanya saat
ditetesi oleh safranin.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, dapat ditarik kesimpulan bahwa:
1. Pewarnaan gram adalah salah satu metode untuk mengidentifikasi jenis bakteri
dapan tergolong ke dalam bakteri gram postif atau bakteri gram negatif.
2. Saat diuji dengan kristal violet dan safranin, bakteri gram positif akan berwarna
ungu karena kandungan peptidoglikan yang banyak sehingga dapat mempertahankan
warna pada kristal violet, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah
karena memiliki dinding sel yang tipis serta mengandung sedikit peptidoglikan,
sehingga tidak dapat mempertahankan warna dari kristal violet.

5.2 Saran
Sebaiknya praktikan harus lebih mengetahui terlebih dahulu prinsip dari praktikum
yang akan dilakukan sehingga dapat meminimalisir kesalahan yang akan terjadi
selama praktikum berlangsung.
 DAFTAR PUSTAKA

Aryulina, D. 2004. Biologi Umum. Jakarta : Erlangga

Campbell, N.A., Reece, J.B., .2003. Biologi Edisi Kelima Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. Bogor : IPB
James, Joyce. 2002. Prinsip - Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Jakarta: Erlangga
Karmana, O. 2008. Biologi. Jakarta: PT Grafindo Media Pratama.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Rajawali
Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. 2007. Dasar-dasar mikrobiologi. Jilid ke-1. Jakarta: UI Press.
Suriawiria. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti
Waluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.