BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative,
berdasarkan sifat kimia dan  fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama
berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan
antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia .
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu atau
Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru
atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram negative adalah
bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode
pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah
dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu,
yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda.
Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan  kedua tipe bakteri tersebut
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti
atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetative ataupun
mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada
umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan
larutan hijau malasit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan
hijau malasit. Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam
endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit. Teknik tersebut akan menghasilkan
warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetative (James 2002).
1.2 Tujuan
1. Mahasiswa mampu melakukan teknik pewarnaan gram.
2. Mahasiswa mengetahui bentuk morfologi bakter dengan jelas dengan aplikasi teknik
pewarnaan gram.
3. Mahasiswa mampu mengidentifikasi bakteri dengan teknik pewarnaan gram.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan
spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative,
berdasarkan sifat kimia dan  fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarka
penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan
teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan
bakteri Klebsiella pneumonia (Karmana 2008).
Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahanka zat warna metil ungu atau
Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau
merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri. Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram.
Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,
sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal
(counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang membuat semua
bakteri gram negative menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna
untuk mengklasifikasikan  kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan struktur dinding
sel mereka (Arrmana, 2008).
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung,
2010).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting
dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan
peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri.
Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram
negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis.
Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis
membran sel (Febrin, 2010).
Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti
atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetative ataupun mengamati
bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal
tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit.
Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan hijau malasit. Pengecatan
tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakuan larutan
hijau malasit. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah
pada sel vegetative (James 2002).
Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100
kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan
ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat,
batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk
seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar, 2007).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat
tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan
pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan
pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang
akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah
memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna
yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30
detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah)
selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang
kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan
beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%.
Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan
terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan
Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan  pewarnaan negatif
(Gozali, 2009).
 DAFTAR PUSTAKA
Firmansyah Ricky. 2009. Mudah dan Aktif Belajar Biologi. Grafindo Media Pratama: Jakarta.
James Joyce. 2002. Prinsip-Prinsip Sains Untuk Keperawatan. Terjemahan dari : Principles
of Science for Nurses. Jakarta : Erlangga.
Karmana Oman. 2008. Biologi. Jakarta : PT Grafindo Media Pratama.
Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : PT Raja Grafindo Persada
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007. Elements of Microbiology. Jakarta : Mc Graw Hill Book.
Pearce Evelyn. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Terjemahan dari : Anatomy
and Physiology for Nurses. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama.
Sudjadi Bagod. 2006. Biologi Sains Dalam Kehidupan. Jakarta : Yudhistira Ghalia Indonesia
.
 BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat 3.1.2 Bahan
1. Jarum ose 1. Biakan bakteri
2. Bunsen 2. Alkohol 90%
3. Gelas obyek 3. Pewarna kristal violet
4. Gelas penutup 4. Penguat lugol
5. Mikriskop 5. Aquades
6. Botol semprot
3.2 Cara Kerja
1. Membuat suspensi biakan bateri ke dalam aquades steril
2. Mencuci kaca pbjek dengan alkohol, lalu mengeringkannya di atas api bunsen
3. Memijarkan jaro ose dan menunggunya dingin, kemudian mencelupkan jarum ose ke
dalam suspensi bakteri dengan menggoreskannya pada kaca objek
4. Mengeringkan preparat dengan cara mendekatkannya dengan hawa api. Setelah
kering, menfiksasikannya di atas nyala api beberapa kali agar bakteri dapat lengket
pada gelas objek. Kemudian mendinginkannya
5. Meneteskan zat warna kristal violet pada preparat sebanyak 2 tetes, lalu
mendiamkannya selama 1 menit
6. Kemudian meneteskan penguat lugol sebanyak 1 tetes dan mendiamkannya selama 1
menit
7. Kemudian membilas bekas pewarna di gelas objek menggunakan aquades
8. Lalu tetesi gelas objek dengan peluntur C lalu didiamkan +- 1 menit lalu bilas lagi
dengan air biasa lalu tunggu hingga kering
9. Gelas objek yang telah kering tadi diamati dibawah mikroskop. Bakteri berwarna ungu
adalah gram positif dan merah adalah negatif

BAB IV
HASIL PENGAMATAN
 Gambar Keterangan
Perbesaran lensa 10.10 Keterangan gambar :
Ketika ditetesi zat warna kristal violet
sel bakteri berwarna ungu, ditetesi
penguat lugol warnanya masih tetap
ungu setelah disemprot dengan
aquades dan alkohol warnanya
menjadi merah.

Warna sel bakteri : merah

sehingga bakteri tersebut masuk
dalam kelompok bakteri gram negatif
Perbesaran 4.10 Keterangan gambar :
Ketika ditetesi zat warna kristal violet
sel bakteri berwarna ungu, ditetesi
penguat lugol warnanya masih tetap
ungu setelah disemprot dengan
aquades dan alkohol warnanya
menjadi merah.

Warna sel bakteri : merah

sehingga bakteri tersebut masuk
dalam kelompok bakteri gram negatif
 BAB V
PEMBAHASAN
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna (Manurung,
2010).
Bakteri gram negatof memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid). Bakteri gram positif memiliki selapis diding sel berupa peptidoglika
yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat
dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Pebrin, 2010)
Pada pengamatan yang kami lakukan yaitu hasil pengamatan tentang ciri-ciri bakteri yang
pertama ciri-ciri bakteri dari bentuk, bentuk yang kami amati bahwa bakteri termasuk
kedalam bentuk cular. Pengamatan selanjutnya dari tepi koloni pada bakteri, dari tepi koloni
bakteri termasuk ke dalam golongan bakteri yang memiliki tepi rata. Selanjutnya yaitu
pengamatan dari struktur bakteri, bakteri yang kami amati termasuk ke dalam struktur yang
smooth. Selanjutnya dari segi elavasinya, pada bakteri elavasinya cenderung tergolong ke
dalam bentuk low convek.
Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100
kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan
ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat,
batang dan spiral. Bakteri lebih sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat
pewarna kimia agar mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk,
susunan dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat berbentuk
seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Chan, 2007).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi
karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat
tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan
pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan
metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut merupakan
pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua kelompok fisiologi, yang
akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur pertama dari pewarnaan gram ini adalah
memberi pewarna kristal violet, setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna
yodium, setelah satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30
detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta warna merah)
selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan membentuk senyawa yang
kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci dan
beberapa bakteri yang lain zat pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%.
Bakteri gram positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan
terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:
pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam),
pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora,
pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan
Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan  pewarnaan negatif
(Gozali, 2009).
Dari hasil pengamatan pewarnaan gram yang kami miliki yaitu media tanah bambu
dan media ragi, kami melakukan pengamatan dengan perbesaran 4*10, hasil yang kami
dapatkan yaitu pada media tanah bambu bahwa bakteri termasuk ke dalam kelompok bakteri
gram positif karena meghasilkan warna sel bakteri berwarna ungu. Pada media ragi yang kami
dapatkan adalah media ragi termasuk ke dalam jenis kelompok bakteri gram negatif karena
hasil yang didapatkan bahwa media ragi memiliki sel berwarna merah, namun hasil
pengamatan kami ini tidak sepenuhnya benar karena kami kekurangan bahan untuk
melakukan percobaan.
BAB VI
PENUTUP
6.1 Kesimpulan
1. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting digunakan
untuk mengidentifikasi bakteri.
2. Ada tiga macam bentuk morfologi bakteri yaitu, spiral, vibrio dan spiroseta.
3. Pada praktikum mikrobiologi ini praktikan dapat mengetahui dan dapat
mengidentifikasi bakteri dengan teknik pewarnaan gram.
6.2 Saran
Diharapkan alat dan bahan untuk praktikum bisa dilengkapi agar tidak ada acara
praktikun yang tidak dilakukan seperti yang terjadi pada shift ini.