Kelompok 12

Metode Uji Potensi

Antibiotika
Dosen Pengampu : apt. Ibu Eva Diansari Purba

Kelas : 2.5
 NAMA ANGGOTA
KELOMPOK

• Putri Meiwanda Sari (200205237)

• Herdi Marettiany Napitupulu (200205223)
• Julia Anggraini (200205228)
• Fitri Pasaribu (190205200)
Pengertian Antibiotik
Antibiotik adalah senyawa kimia yang dalam
kadar rendah mempunyai kemampuan untuk
menghambat (bakteriostatik) atau menghancurkan
(bakterisidal) bakteri atau mikrooganisme lain
(Herawati & Irawati, 2011).
Menurut Bezoen et al 2001), beberapa antibiotik
bersifat aktif terhadap beberapa spesies bakteri
(berspektrum luas) sedangkan antibiotik lain bersifat
lebih spesifik terhadap spesies bakteri tertentu
(berspektrum sempit).

Sumber : WARTA AKAB VOLUME 45, NO. 2, DESEMBER 2021, PP: 17-23
 Pengertian Antibiotik
Pengujian potensi antibiotik dilakukan secara
mikrobiologi dengan metode cylinder plate yang telah
mengalami pengembangan dan sudah divalidasi. Untuk
mengonfirmasi unjuk kerja dalam memberikan hasil
yang andal maka perlu dilakukan verifikasi metode.
Verifikasi metode dilakukan dengan menguji parameter
presisi, akurasi, dan linearitas. Pengujian ini bermanfaat
untuk memberikan informasi bahwa metode pengujian
potensi antibiotik secara mikrobiologi dengan metode
cylinder plate pada produk menghasilkan data yang
andal dan dapat digunakan untuk analisis di
laboratorium quality control serta menunjukkan bahwa
produk terjamin kualitasnya.
Sumber : WARTA AKAB VOLUME 45, NO. 2, DESEMBER 2021, PP: 17-23
 Mengapa antibiotik perlu
ditentukan kadar atau potensinya?
• Efek penggunaan antimikroba yang meningkat, sehingga
meningkatkan pula efek resistensi berbagai mikroba patogen
• Mikroba patogen dan virus baru : HIV, Avian Flu Virus
• Efektivitas daya hambat atau daya bunuh antimikroba sangat
tergantung pada jumlah dan kekuatan zat aktif nya
Sumber : Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy ITB

Uji potensi antibiotik secara mikrobiologi adalah suatu tehnik untuk

menetapkan suatu potensi antibiotik dengan mengukur efek
senyawa tersebut terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji yang
peka dan sesuai. Efek yang ditimbulkan pada senyawa uji dapat
berupa hambatan pertumbuhan.
Sumber : Vol. 3 | No. 3 | Desember 2019 | Jurnal Medical Profession (MedPro)
Mengapa dilakukan secara Mikrobiologi ?
• Respons mikroba terhadap antibiotik
berbeda-beda
• Spesifik
• Sensitif
 Potensi vs Kadar ?
Potensi = ukuran kekuatan /daya hambat atau
daya bunuh zat aktif terhadap mikroorganisme
tertentu
Kadar = jumlah per satuan berat/volume
SPEKTRUM ANTIBIOTIK
Spektrum Antibiotik terbagi 2 yaitu :
• Spektrum Luas (antibiotik broad spectrum),
yang termasuk golongan ini yaitu tetrasiklin
dan derivatnya, kloramfenikol, ampisilin,
sefalosporin, carbapenem, dll.
• Spektrum Sempit (antibiotik narrow
sepectrum), yang termasuk golongan ini adalah
penisilin, streptomisilin, neomisin, basitrasin.

Sumber : Hubungan Antar Tingkat..., Nadia Wahyu Pangestika, Fakultas Farmasi UMP, 2017
SPEKTRUM BEBERAPA
ANTIBIOTIK
 SKEMA ANALISIS PATOGEN
DAN METODE ANALISIS YANG
DIGUNAKAN

• ELISA untuk analisis antigen spesifik pada

mikroba patogen
• Uji senyawa antibiotik untuk penentuan
KHM antibiotik mikroba suspect
 Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan
Farmakope Indonesia Edisi IV 1995

Estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan

langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan antibiotik
standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi
dengan baik, dan umum digunakan sebagai sebagai rujukan
 TUJUAN UJI
Sebagai standar untuk mengatasi keraguan tentang
kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi) antibiotik
terhadap efek daya hambatnya pada mikroba

METODE UMUM

1. Lempeng ( Silinder/Kertas Cakram )

2. Turbidimetri ( Tabung )
METODE LEMPENG SILINDER

Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus

pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng
yang berisi biakan mikroba uji pada jumlah tertentu

Mikroba dihambat pertumbuhannya

METODE TURBIDIMETRI
• Hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan
serba sama antibiotik, dalam media cair yang dapat
menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak
terdapa antibiotik.
• Metode turbidimetri digunakan pada sampel yang sulit
larut dalam air, contoh: Gramisidin
 PERSIAPAN UJI
• Mikroorganisme
• Bahan
• Alat
 Peralatan
• Semua peralatan harus dicuci bersih sesudah sebelum
dan digunakan.
• Peralatan gelas untuk menyimpan dan memindahkan
mikroorganisme uji, disterilkan dengan pemanasan kering
atau dengan uap air.
 Pengendalian Termostatik
Selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan
tabung
• Metode lempeng = ± 0,5°C
• Metode turbidimetri = ± 0,1°C suhu dapat diperroleh dengan
sirkulasi udara dan air
Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa tahap
penetapan secara mikrobiologi, waktu membiakkan
mikroorganisme dan penyiapan inokulanya, selama inkubasi
dalam penetapan pada lempeng dan tabung. Suhu pada
penetapan dengan cara lempeng dipertahankan pada lebih
kurang 0,5°C dari suhu yang dipilih. Pengendalian suhu yang
lebih dekat (lebih kurang 0,1°C dari suhu yang dipilih) sangat
penting untuk Inkubasi pada penetapan dengan cara tabung,
hal Ini dapat diperoleh dengan sirkulasi udara atau air,
kapasitas panas dari air lebih besar lebih menguntungkan
daripada sirkulasi udara.
Wadah Untuk Penetapan Secara
Lempeng-Silinder
• Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan petri
kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x 100 mm) yang
mempunyai tutup dari bahan yang sesuai.
• Untuk silinder, gunakan silinder besi tahan karat atau
porselen dengan toleransi ukuran masing-masing lebih
kurang 0,1 mm; diameter luar 8 mm, diameter dalam 6
mm, dan tinggi 10 mm.
• Cuci silinder dengan saksama untuk membersihkan
semua residu, kadang kadang diperlukan suatu asam
seperti asam nitrat 2 N atau asam kromat
Wadah Untuk Penetapan Secara
Turbidimetri
• Untuk penetapan dengan cara tabung reaksi kaca atau
plastik dengan ukuran misalnya 16 mm x 125 mm x atau
18 mm x 150 mm yang panjang, diameter dan
ketebalannya relatif seragam serta permukaannya tidak
cacat dan tidak tergores.
• Tabung yang akan ditempatkan pada spektrofotometer
harus yang sesuai, tanpa goresan dan tidak cacat.
• Bersihkan saksama tabung dari semua residu antibiotika
dan sisa larutan pembersih, dan sterilkan sebelum
digunakan untuk penetapan berikutnya.
MEDIA DAN LARUTAN
DAPAR
 MEDIA
Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula mikroorganisme dibuat
dari bahan-bahan yang tertera di bawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-
masing bahan, atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan
dengan syarat media yang dihasilkan mempunyai daya menumbuhkan yang
sama atau lebih baik dan memberikan respons kurva baku yang sama.
Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1 L, dan atur pH larutan
menggunakan natrium hidroksida 1 N atau asam klorida 1 N, hingga
sesudah sterilisasi uap air didapatkan pH media sesuai.
 UNIT DAN BAKU PEMBANDING
• Potensi antibiotika dinyatakan dalam "unit" atau "μg"
aktivitas antibiotika Baku Pembanding Farmakope
Indonesia (BPFI) dikalibrasi terhadap baku primer
antibiotika yang bersangkutan. Antibiotika BPFI dibuat dan
diedarkan oleh instansi yang berwenang.
• Pengertian "μg" aktivitas berasal dari sediaan antibiotika
yang dipilih sebagai baku pembanding yang dianggap
secara keseluruhan terdiri dan bahan kimia tunggal, dan
oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 "μg" per mg.
• Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode
pembuatan dan pemurnian antibiotika tertentu, aktivitas
sediaan dapat lebih dari 1000 sediaan yang demikian per
mg.
Karenanya dapat dimengerti bahwa sediaan yang demikian
mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlah tertentu "μg" baku
pembanding asli. Tetapi pada umumnya "μg" aktivitas adalah tepat
setara secara numerik dengan µg (bobot) sediaan mumi. Kesulitan
timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotika terdiri dari
bentuk basa bebas dan garamnya, dan "ug" aktivitas dinyatakan
terdiri salah satu dari bentuk tersebut, bahan antibiotika terdiri dari
sejumlah komponen yang memiliki sifat kimia yang sangat mirip
tetapi mempunyai aktivitas antibiotika yang berbeda, atau potensi
dari satu kelompok antibiotika dinyatakan dengan baku
pembanding yang merupakan salah satu antibiotika anggotanya,
tetapi sediaan itu sendiri dapat tidak serba sama (heterogen).
Dalam hal ini "μg" aktivitas dinyatakan dalam "unit". "μg"
aktivitas harus tidak dianggap sama dengan ug (bobot) dari bahan
antibiotika.
 Ketentuan
Ampisilin : buat enceran larutan baku
• pembanding dan larutan uji secara bersamaan
• Zink Basitrasin : tiap enceran larutan baku
• harus mengandung asam klorida sejumlah
• sama dengan larutan uji.
• Secara umum pengeringan dilakukan pada
• oven hampa udara 5 mmHg, 60°C, selama 3 jam.
 Penyiapan Contoh
• Buat larutan serta enceran larutan uji sesuai dengan
antibiotik pembanding
• Penetapan hanya membutuhkan 1 tingkat dosis uji
yang sesuai dengan dosis tengah baku pembanding

Dosis uji (U) = Dosis S3

Mikroba Uji dan Inokula
 Mikroba UJI

• Mikroba uji untuk masing-masing antibiotik tertera pada Tabel 2,

pelihara pada agar miring dan inkubasikan sesuai dengan Tabel 3
• Mikroba uji harus merupakan galur murni dan dipindahkan setiap
minggu.
• Pada Klebsiella pneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul
 Penyiapan Inokula

• Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segar mikroorganisme dari

agar miring atau biakan lain ke permukaan 250 ml media agar dalam sebuah
botol Roux, kecuali untuk Streptococcus faccium dibiakkan dalam media
cair. Sebarkan suspensi secara merata ke atas permukaan agar suspensi
dengan bantuan butiran kaca steril dan inkubasikan pada suhu yang
ditetapkan selama waktu tertentu.
• Pada akhir periode inkubasi, buat suspensi persediaan dengan
mengumpulkan biakan permukaan ke dalam 50 ml larutan natrium klorida
0,9 % steril kecuali untuk Bleomisin (gunakan 50 ml Media 34)
 Penyiapan Inokula

• Atur perbandingan hingga inokula mempunyai transmitans 25 % terhadap

blangko.
• Untuk penetapan turbidimetri, optimalkan hubungan antara dosis dan
respon.
• Pada penetapan lempeng silinder, atur larutan suspensi hingga menghasilkan
batas daerah hambatan yang memuaskan; yaitu 14 mm-16 mm
Cara Pengujian
 • Rancangan Penetapan

Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi yang meyakinkan melalui pemisahan

sumber-sumber penyebab kesalahan potensial serta blas yang relatif besar dengan
menggunakan rancangan penetapan yang sesual. Pada penetapan dengan metode lempeng-
silinder, perbandingan pokok dibatasi hubungan pengukuran diameter hambatan antar
lempeng, tidak termasuk variasi di antara lempeng pada penyiapannya dan penanganan
berikutnya. Untuk melaksanakan penetapan turbidimetri sehingga perbedaan kekeruhan
yang diamati akan menggambarkan perbedaan kadar keseragaman suhu tabung melalul
antibiotika, diperlukan Inkubator dan penghindaran blas sistemendall termostatik dalam
dengan penempatan tabung secara acak dalam rak terpisah, setiap rak terdiri dari satu set
perlakuan yang lengkap. Perbandingan pokok kemudian dibatasi pada hubungan antara
kekeruhan yang diamati pada setiap rak.
2. Metode Lempeng Silinder

Pada penyiapan lempeng penetapan menggunakan cawan petri, tuang 21 ml Media 2

dalam masing-masing dari sejumlah cawan yang diperlukan dan biarkan memadat sebagai
lapisan dasar yang licin dengan ketebalan seragam, kecuali untuk Amfoterisin B, dan
Nistatin, tidak digunakan lapisan dasar yang terpisah.
3. Metode Turbidimetri
Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan dengan mengencerkan larutan
persediaan baku dan setiap larutan uji Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-masing
3 tabung reaksi yang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi
secara acak pada rak tabung. Secara bersamaan letakkan pada setiap rak 1 tabung atau 2
tabung kontrol yang berisi pengencer ml tetapi tanpa antibiotika. Setelah selesai semua
pengisian larutan (untuk Kandisidin dalam waktu 30 menit ketika air ditambahkan pada
larutan persediaan metil sulfoksida), tambahkan 9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung
pada rak dan setelah lengkap pengisian rak segera ditempatkan dalam Inkubator atau
tangas air dengan suhu yang dipertahankan pada 36°C sampal 37,5°C selama 2 jam
sampai 4 jam, kecuali untuk Kandisidin (inkubasi pada suhu 27°C sampai 29°C selama
16 jam sampai 18 jam). Setelah inkubasi, tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encer
ke dalam setiap tabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukur
transmitans atau serapan pada 530 nm.
4. Cara Menghitung Potensi
Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh dengan metode
lempeng silinder atau turbidimetri dilakukan dengan menggunakan metode
garis lurus transformasi log dengan prosedur penyesuaian kuadrat terkecil
dan uji linieritas. Bila sejumlah penetapan dari bahan uji yang sama
dilakukan menggunakan kurva baku yang sama, hitung koefisien variasi
dari hasil semua penetapan bahan uji. Bila lebih dari satu penetapan
dilakukan untuk bahan uji yang sama dengan kurva baku yang berbeda,
buat rata-rata dari dua atau lebih nilai potensi
Pemasangan silinder / cakram filter pada lapisan agar dalam cawan petri

• Letakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertas dengan jarak satu
sama lain + 20-25 mm.

Cara meneteskan larutan uji (U) dan larutan standar(S)

• Urutan penetesan seperti pada gambar.
• Teteskan setiap pengenceran 20 μl pada silinder atau cakram kertas
(diameter 6 mm).
• Pada waktu meneteskan pada silinder besi tahan karat jangan kena
dinding silinder.
• Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37°C.
Cara 1
Untuk Pengujian 3 dosis setiap sediaan

Standar (S) Uji (u)

Jumlah zona kons. rendah S--₁ U₁

Jumlah zona kons. menengah S₂ U₂

Jumlah zona kons. tinggi S₃ U₃

Jumlah Sediaan S₁+S₂+S₃=S U₁+U₂+U₃=U

Kontras Linear S₃-S₁= Ls u₃-U₁= Lu

b = Ls + Lu Yu = U

d - 1 (Inh) nd

Mu = Yu - Ys
Ys = S
b
nd
 • Rasio Potensi RU = antilog M₁
• Potensi RU x 10

Keterangan :
b = slope regresi zona log kons. semua sediaan
d = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3
h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2
n = banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6
I = interval log konsentrasi berdampingan
(log S1-log S2 = log S2- log S3)
 • Cara 2

Untuk 2 dosis setiap sediaan

U1 & S1 = diameter hambatan dosis tinggi
U2 & S2 = diameter hambatan dosis rendah

log U = (U₁ + U₂) - (S₁ + S₂)

x log4
S (U₁ +S₁) - (U₂ + S₂ )

log P
S1 = 1 µg 4x ==>log 4
S2 = 4 µg
S1 = 1 µg 2x ==>log 2
S2=2 µg
 • Cara 3

Untuk 2 dosis setiap sediaan

Potensi = antilog (F/E x log KT/KR) x potensi standar (dalam µg/g atau %)
E = 1/2 (ST-SR + BT-BR)
F = 1/2 (ST + SR-BT-BR)

ST = rata-rata zona hambatan larutan sampel tinggi

SR = rata-rata zona hambatan larutan sampel rendah
BT = rata-rata zona hambatan larutan baku tinggi
BR = rata-rata zona hambatan larutan baku rendah
KT = konsentrasi tinggi
KR konsentrasi rendah

Contoh uji potensi untuk 2 dosis setiap sediaan

U1 = 25 mm S1 = 24,8 mm
U2 = 20 mm S2 = 20 mm
KT 10 µg/ml KR = 5 µg/ml
 • Cara 4

Dengan 3 dosis atau 4 dosis setiap sediaan

Larutan uji
Dibuat larutan uji menggunakan pelarut yang sesuai untuk uji potensial
sehingga diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 µg/ml (100 ppm)

Encerkan larutan stok ini hingga diperoleh larutan dengan kadar seperti di
bawah ini:

U8 0,2 ppm
U4 0,1 ppm
U2 0,05 ppm
U1 0,025 ppm
Larutan sampel
Siapkan larutan sampel yang konsentrasinya berada di antara
konsentrasi larutan uji

S8 ± 0,2 ppm
S4 ±0,1 ppm
S2 ± 0,05 ppm
S1 ± 0,025 ppm
Cara penetapan potensi

• Lakukan uji menggunakan cawan petri yang diisi dengan 4 konsentrasi

larutan uji (U1, U2, U4, U8) dan konsentrasi larutan sampel (S1, S2, S4,
S8).
• Jarak masing-masing cakram tidak kurang dari 30 mm, karena diduga
konsentrasi yang dijarakkan akan memberi diameter hambatan sekitar 10-13
mm
• Lakukan inkubasi selama 24 jam.
Cara Perhitungan
• Untuk 3 dosis setiap sediaan

log P = (U₁ + U₂+ U₄) - (S₁ + S₂ + S₄)

x log 3
(U₁ + U₄) - (U₁ + S₁)

atau = (U₂ + U₄ + U₈) - (S₂ + S₄ + S₈)

x log 3
(U₈ +S₈) - (U₂+ S₂)

• Untuk 4 dosis setiap sediaan

log P = (U₄ + U₂ + U₄ + U₈) - (S₁+ S₂ + S₄ + S₈)

x log 4
(U₄ + U₈ + S₄ +S₈)- (U₁+ U₂ + S₁ + S₂)
 • Perhitungan potensi antibitika secara turbidimetri

Rumus =
L = 3a + 2b + c - e L = Harga serapan (A) yang terendah yang dihasilkan
kosentrasi terendah pada kurva kalibrasi

5 H = Harga serapan (A) tertinggi yang boleh dihasilkan oleh

konsentrasi pada kurva kalibrasi a, b, c, d, e = Harga serapan
H = 3e + 2d + c - a yang dihasilkan dari konsentrasi terendah (a) sampal
konsentrasi tertinggi (e)

Dengan memasukkan harga serapan dari sampel ke kurva kalibrasi akan diperoleh potensi
(µg/ml) dari sampel.
Thanks a lot
FOR YOUR
TIME