Analisis Hayati

PENETAPAN POTENSI ANTIBIOTIKA

SECARA MIKROBIOLOGI

Oleh : Dr. Harmita

Pendahuluan
• Aktivitas (potensi) antibiotika dapat ditunjukkan pada
kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatan
terhadap mikroorganisme. Suatu penurunan aktivitas
antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan
kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia,
sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi
biasanya merupakan standar untuk mengatasi keraguan
tentang kemungkinan hilangnya aktivitas. Bab ini
meringkaskan cara kerja penetapan antibiotika dengan
pengujian secara mikrobiologi.
• Ada dua metode umum yang dapat digunakan, yaitu
penetapan dengan lempeng-silinder atau “lempeng” dan
penetapan dengan cara “tabung” atau turbidimetri
Peralatan

• Semua peralatan harus dicuci bersih

sebelum dan sesudah digunakan.
Peralatan gelas untuk menyimpan dan
memindahkan mikroorganisme uji,
disterilkan dengan pemanasan kering atau
dengan uap air.
Pengendalian Suhu
• Pengendalian termostatik diperlukan dalam beberapa
tahap penetapan secara mikrobiologi, waktu
membiakkan mikroorganisme dan penyiapan inokulanya,
selama inkubasi dalam penetapan pada lempeng dan
tabung. Suhu pada penetapan dengan cara lempeng
dipertahankan pada lebih kurang 0,5°C dari suhu yang
dipilih. Pengendalian suhu yang lebih dekat (lebih
kurang 0,1°C dari suhu yang dipilih) sangat penting
untuk inkubasi pada penetapan dengan cara tabung, hal
ini dapat diperoleh dengan sirkulasi udara atau air,
kapasitas panas dari air yang lebih besar lebih
menguntungkan daripada sirkulasi udara.
Spektrofotometer
• Pengukuran transmitans dalam pita frekuensi yang
sempit, membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan
mempunyai sumber cahaya panjang gelombang yang
dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 530 nm
untuk pengukuran serapan pada pengujian dengan cara
tabung. Untuk tujuan tersebut, alat dapat diatur hingga
dapat menerima tabung yang digunakan untuk inkubasi
dan menggunakan sel yang dimodifikasi yang dilengkapi
dengan pipa pembuangan untuk memudahkan
pertukaran isi dengan cepat, atau lebih disukai sel yang
mempunyai saluran untuk pengaliran secara sinambung
selama pengukuran. Atur serapan dengan blangko untuk
serapan nol menggunakan media cair yang jernih tanpa
inokula yang disiapkan seperti dinyatakan untuk
masing-masing antibiotika, termasuk sejumlah yang
sesuai larutan uji dan formaldehida dalam setiap contoh.
Wadah Untuk Penetapan
Secara Lempeng-Silinder
• Untuk penetapan cara lempeng, gunakan cawan
petri kaca atau plastik (lebih kurang 20 mm x
100 mm) yang mempunyai tutup dari bahan
yang sesuai. Untuk silinder, gunakan silinder
besi tahan karat atau porselen dengan toleransi
ukuran masing-masing lebih kurang 0,1 mm;
diameter luar 8 mm, diameter dalam 6 mm, dan
tinggi 10 mm. Cuci silinder dengan saksama
untuk membersihkan semua residu, kadang-
kadang diperlukan suatu asam seperti asam
nitrat 2 N atau asam kromat
Wadah Untuk Penetapan
Secara Turbidimetri
• Untuk penetapan dengan cara tabung reaksi
kaca atau plastik dengan ukuran misalnya 16
mm x 125 mm x atau 18 mm x 150 mm yang
panjang, diameter dan ketebalannya relatif
seragam serta permukaannya tidak cacat dan
tidak tergores. Tabung yang akan ditempatkan
pada spektrofotometer harus yang sesuai, tanpa
goresan dan tidak cacat. Bersihkan saksama
tabung dari semua residu antibiotika dan sisa
larutan pembersih, dan sterilkan sebelum
digunakan untuk penetapan berikutnya.
Media
• Media yang diperlukan untuk penyiapan inokula
mikroorganisme dibuat dari bahan-bahan yang tertera di
bawah ini. Sedikit modifikasi dari masing-masing bahan,
atau media kering yang direkonstitusi, dapat dilakukan
dengan syarat media yang dihasilkan mempunyai daya
menumbuhkan yang sama atau lebih baik dan
memberikan respons kurva baku yang sama. Larutkan
bahan-bahan dalam air hingga 1 L, dan atur pH larutan
menggunakan natrium hidroksida 1 N atau asam klorida
1 N, hingga sesudah sterilisasi uap air didapatkan pH
media sesuai.
 Unit dan Baku Pembanding
• Potensi antibiotika dinyatakan dalam “unit” atau “µg” aktivitas
antibiotika. Baku Pembanding Farmakope Indonesia (BPFI) dikalibrasi
terhadap baku primer antibiotika yang bersangkutan. Antibiotika BPFI
dibuat dan diedarkan oleh instansi yang berwenang.
• Pengertian “µg” aktivitas berasal dari sediaan antibiotika yang dipilih
sebagai baku pembanding yang dianggap secara keseluruhan terdiri dari
bahan kimia tunggal, dan oleh karena itu dinyatakan potensi 1000 “µg”
per mg. Dalam beberapa hal, sebagai hasil pengembangan metode
pembuatan dan pemurnian antibiotika tertentu, aktivitas sediaan dapat
lebih dari 1000 “µg” per mg. Karenanya dapat dimengerti bahwa
sediaan yang demikian mempunyai aktivitas yang setara dengan jumlah
tertentu “µg” baku pembanding asli. Tetapi pada umumnya “µg”
aktivitas adalah tepat setara secara numerik dengan µg (bobot) sediaan
murni. Kesulitan timbul pada beberapa keadaan seperti jika antibiotika
terdiri dari bentuk basa bebas dan garamnya, dan “µg” aktivitas
dinyatakan untuk salah satu dari bentuk tersebut, bahan antibiotika
terdiri dari sejumlah komponen yang memiliki sifat kimia yang sangat
mirip tetapi mempunyai aktivitas antibiotika yang berbeda; atau potensi
dari satu kelompok antibiotika dinyatakan dengan baku pembanding
yang merupakan salah satu antibiotika anggotanya, tetapi sediaan itu
sendiri dapat tidak serba sama (heterogen). Dalam hal ini “µg” aktivitas
dinyatakan dalam “unit”. “µg”aktivitas harus tidak dianggap sama
dengan µg (bobot) dari bahan antibiotika.
•
Penyiapan Baku
• Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah
baku pembanding antibiotika yang ditimbang saksama
dan sebelumnya telah dikeringkan seperti yang tertera
pada Tabel 2.1, atau seluruh isi satu vial, jika
diperlukan, dalam pelarut seperti yang tertera pada tabel
2.1. tersebut, kemudian encerkan hingga kadar yang
dikehendaki. Simpan dalam lemari pendingin dan
gunakan dalam waktu yang ditentukan. Pada hari
penetapan, buat pengenceran dari larutan persediaan 5
atau lebih larutan untuk pengujian dengan kadar
perbandingan 1:1,25 untuk penetapan dengan cara
lempeng silinder atau lebih kecil untuk penetapan
turbidimetri. Gunakan pengencer akhir yang dinyatakan
dan urutan kadar dengan dosis tengah yang ditentukan.
Mikroorganisme dan Inokula

Mikroorganisme Uji
• Mikroorganisme uji untuk setiap antibiotika
tertera pada Tabel 2.2 beserta nomor identifikasi
American Type Culture Collection (ATCC) yang
bersangkutan. Metode penetapan dengan
mikroorganisme uji tersebut tertera pada Tabel
2.1. pelihara biakan pada media agar miring
dengan kondisi inkubasi seperti tertera pada
Tabel 2.3 dan pindahkan setiap minggu pada
agar miring yang baru. Untuk Klebsiella
pneumoniae gunakan biakan tidak berkapsul.
Penyiapan Inokula
• Untuk persiapan penetapan, inokulasikan biakan segar
mikroorganisme dari agar miring atau biakan lain ke
permukaan 250 ml media agar dalam sebuah botol
Roux, kecuali untuk Streptococcus faccium dibiakkan
dalam media cair. Sebarkan suspensi secara merata ke
atas permukaan agar suspensi dengan bantuan butiran
kaca steril dan inkubasikan pada suhu yang ditetapkan
selama waktu tertentu. Pada akhir periode inkubasi,
buat suspensi persediaan dengan mengumpulkan biakan
permukaan ke dalam 50 ml larutan natrium klorida 0,9
% steril kecuali untuk Bleomisin (gunakan 50 ml Media
34)
Cara Pengujian.
• Rancangan Penetapan.
Penetapan secara mikrobiologi memperoleh presisi yang
meyakinkan melalui pemisahan sumber-sumber penyebab
kesalahan potensial serta bias yang relatif besar dengan
menggunakan rancangan penetapan yang sesuai. Pada penetapan
dengan metode lempeng-silinder, perbandingan pokok dibatasi
hubungan pengukuran diameter hambatan antar lempeng, tidak
termasuk variasi di antara lempeng pada penyiapannya dan
penanganan berikutnya. Untuk melaksanakan penetapan
turbidimetri sehingga perbedaan kekeruhan yang diamati akan
menggambarkan perbedaan kadar antibiotika, diperlukan
keseragaman suhu tabung melalui pengendali termostatik dalam
inkubator dan penghindaran bias sistematik dengan penempatan
tabung secara acak dalam rak terpisah, setiap rak terdiri dari satu
set perlakuan yang lengkap. Perbandingan pokok kemudian
dibatasi pada hubungan antara kekeruhan yang diamati pada
setiap rak.
Metode Lempeng Silinder
• Pada penyiapan lempeng penetapan
menggunakan cawan petri, tuang 21 ml
Media 2 dalam masing-masing dari
sejumlah cawan yang diperlukan dan
biarkan memadat sebagai lapisan dasar
yang licin dengan ketebalan seragam,
kecuali untuk Amfoterisin B, dan Nistatin,
tidak digunakan lapisan dasar yang
terpisah
Metode Turbidimetri
• Pada hari penetapan, dipakai dosis yang diperlukan dengan
mengencerkan larutan persediaan baku dan setiap larutan uji.
Tambahkan 1 ml setiap dosis pada masing-masing 3 tabung reaksi
yang telah disiapkan dan tempatkan 3 replikat tabung dengan posisi
secara acak pada rak tabung. Secara bersamaan letakkan pada
setiap rak 1 tabung atau 2 tabung kontrol yang berisi 1 ml
pengencer tetapi tanpa antibiotika. Setelah selesai semua pengisian
larutan (untuk Kandisidin dalam waktu 30 menit ketika air
ditambahkan pada larutan persediaan metil sulfoksida), tambahkan
9,0 ml inokula ke dalam setiap tabung pada rak dan setelah lengkap
pengisian rak segera ditempatkan dalam inkubator atau tangas air
dengan suhu yang dipertahankan pada 36°C sampai 37,5°C selama
2 jam sampai 4 jam, kecuali untuk Kandisidin (inkubasi pada suhu
27°C sampai 29°C selama 16 jam sampai 18 jam). Setelah inkubasi,
tambahkan 0,5 ml larutan formaldehida encer ke dalam setiap
tabung pada satu rak dalam waktu yang bersamaan, dan ukur
transmitans atau serapan pada 530 nm.
Cara Menghitung Potensi.
• Untuk menghitung potensi dari data yang diperoleh
dengan metode lempeng silinder atau turbidimetri
dilakukan dengan menggunakan metode garis lurus
transformasi log dengan prosedur penyesuaian kuadrat
terkecil dan uji linieritas. Bila sejumlah penetapan dari
bahan uji yang sama dilakukan menggunakan kurva
baku yang sama, hitung koefisien variasi dari hasil
semua penetapan bahan uji. Bila lebih dari satu
penetapan dilakukan untuk bahan uji yang sama dengan
kurva baku yang berbeda, buat rata-rata dari dua atau
lebih nilai potensi
Pemasangan silinder / cakram filter pada
lapisan agar dalam cawan petri

• Letakkan silinder besi tahan karat atau cakram kertas

dengan jarak satu sama lain + 20-25 mm.

Cara meneteskan larutan uji (U) dan larutan standar(S)

• Urutan penetesan seperti pada gambar.
• Teteskan setiap pengenceran 20 µl pada silinder atau
cakram kertas (diameter 6 mm)
• Pada waktu meneteskan pada silinder besi tahan karat
jangan kena dinding silinder.
• Inkubasi selama 18-24 jam suhu 37°C.
• Cara 1:
Untuk pengujian 3 dosis setiap sediaaan
Standar (S) Uji (U)

Jumlah zona kons. rendah S­­1 U1

Jumlah zona kons. menengah S2 U2
Jumlah zona kons. tinggi S3 U3
Jumlah sediaan
S1+S2+S3=S U1+U2+U3=U
Kontras linier
S3-S1=LS U3-U1=LU

LS + LU U
b= YU =
(d − 1) Inh nd
S YU − YS
YS = MU =
nd b
• Rasio Potensi RU = antilog MU
• Potensi = RU x 100%
Keterangan :
b = slope regresi zona log kons. semua sediaan
d = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3
h = banyaknya sediaan termasuk standar = 2
n = banyaknya penggandaan setiap perlakuan = 6
I = interval log konsentrasi berdampingan
(log S1-log S2 = log S2- log S3)
• Cara 2 :
Untuk 2 dosis setiap sediaan
U1 & S1 = diameter hambatan
dosis tinggi
U2 & S2 = diameter hambatan U1 & S1 = diameter hambatan
dosis rendah dosis tinggi
U (U + U ) − (S1 + S2 ) U2 & S2 = diameter hambatan
log = 1 2 × log 4
S (U1 + S1 ) − (U 2 + S2 ) dosis rendah
↓↓
log P
S1 = 1 μg  4x ==>log 4
S2 = 4 μg
S1 = 1 μg  2x ==>log 2
S2 = 2 μg
Cara 4
Dengan 3 dosis atau 4 dosis setiap sediaan
Larutan uji
Dibuat larutan uji menggunakan pelarut yang sesuai untuk uji potensial sehingga
diperoleh larutan stok dengan konsentrasi 100 μg/ml (100 ppm)
Encerkan larutan stok ini hingga diperoleh larutan dengan kadar seperti di bawah ini:
U8 0,2 ppm
U4 0,1 ppm
U2 0,05 ppm
U1 0,025 ppm
Larutan sampel
Siapkan larutan sampel yang konsentrasinya berada di antara konsentrasi larutan uji
S8 ± 0,2 ppm
S4 ± 0,1 ppm
S2 ± 0,05 ppm
S1 ± 0,025 ppm
• Cara 3 :
Untuk 2 dosis setiap sediaan
Potensi = antilog (F/E x log KT/KR) x potensi standar (dalam μg/g atau %)
E = 1/2 (ST – SR + BT – BR)
F = 1/2 (ST + SR – BT – BR)

ST = rata-rata zona hambatan larutan sampel tinggi

SR = rata-rata zona hambatan larutan sampel rendah
BT = rata-rata zona hambatan larutan baku tinggi
BR = rata-rata zona hambatan larutan baku rendah
KT = konsentrasi tinggi
KR = konsentrasi rendah

Contoh uji potensi untuk 2 dosis setiap sediaan

U1 = 25 mm S1 = 24,8 mm
U2 = 20 mm S2 = 20 mm
KT = 10 μg/ml KR = 5 μg/ml
Cara penetapan potensi.

• Lakukan uji menggunakan cawan petri yang diisi

dengan 4 konsentrasi larutan uji (U1, U2, U4,
U8) dan konsentrasi larutan sampel (S1, S2, S4,
S8).
• Jarak masing-masing cakram tidak kurang dari
30 mm, karena diduga konsentrasi yang
dijarakkan akan memberi diameter hambatan
sekitar 10-13 mm.
• Lakukan inkubasi selama 24 jam.
Cara perhitungan
1. Untuk 3 dosis setiap sediaan

(U 1 + U 2 + U 4 ) − (S1 + S 2 + S 4 )
log P = × log 3
(U 4 + S 4 ) − (U 1 + S1 )

(U 2 + U 4 + U 8 ) − (S 2 + S 4 + S 8 )
atau = × log 3
(U 8 + S8 ) − (U 2 + S 2 )

2. Untuk 4 dosis setiap sediaan

(U1 + U 2 + U 4 + U 8 ) − (S1 + S2 + S4 + S8 )
log P = x log 4
(U 4 + U 8 + S4 + S8 ) − (U1 + U 2 + S1 + S2 )
 Con’d

• Perhitungan potensi antibiotika secara

turbidimetri
Rumus : L = 3a + 2b + c - e
5
3e + 2d + c - a
H=
5
L = Harga serapan (A) yang terendah yang dihasilkan kosentrasi terendah pada
kurva kalibrasi
H = Harga serapan (A) tertinggi yang boleh dihasilkan oleh konsentrasi pada kurva
kalibrasi a, b, c, d, e = Harga serapan yang dihasilkan dari konsentrasi
terendah (a) sampai konsentrasi tertinggi (e)
Dengan memasukkan harga serapan dari sampel ke kurva kalibrasi akan diperoleh
potensi (µg/ml) dari sampel.