a.

Prosedur Uji Potensi Antibiotik Gentamisin Sesuai FI VI

Penetapan potensi gentamisin tertera pada Farmakope Edisi VI ampiran <131>

halaman 1866 berupa Penetapan Potensi Antibiotik secara Mikrobiologi.
Pengujian gentamisin dilakukan dengan “Cara lempeng”. Pengujian dengan cara
lempeng dilakukan dalam silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar
padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga pertumbuhan mikroba spesifik
yang diinokulasikan dapat dihambat pada daerah disekeliling silinder yang berisi
larutan antibiotic berupa lingkaran atau zona.

 Metode lempeng-Silinder
1. Peralatan dan Kondisi Analisis
Peralatan :

a. Lempeng: Cawan Petri kaca atau plastik sekali pakai (berukuran 20x100
mm atau ukuran lain yang sesuai) dengan penutup.
b. Silinder: Silinder besi tahan karat atau porselen; diameter luar 8 ± 0,1 mm;
diameter dalam 6 ± 0,1 mm; tinggi 10 ± 0,1 mm.
NB : semua peralatan harus dicuci bersih sebelum dan sesudah digunakan
seperti tertera pada lampiran Pencucian Peralatan Kaca <1331>. Peralatan
gelas untuk menyimpan dan memindahkan mikroba uji, disterilkan dengan
pemanasan kering, uap air, radiasi, atau peralatan steril sekali pakai.

Mikroba Uji : Staphylococcus epidermidis (ATCC : 12228)

Pengendalian suhu : menggunakan suhu 36 – 37,5 oC

2. Larutan baku
Tabel 1 Larutan Baku Gentamisin
 (e Huruf D menyatakan Dapar seperti tertera pada Media dan Larutan, Dapar
untuk menjelaskan setiap Dapar dalam tabel ini.)

Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pembanding yang

sesuai dengan antibiotik seperti tertera pada Tabel 1. Simpan pada suhu 2-8 oC,
dan gunakan dalam waktu yang disarankan. Pada hari penetapan, siapkan
pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih larutan untuk pengujian dengan
dosis bertahap, umumnya dengan perbandingan 1:1,25. Gunakan pengencer akhir
yang dinyatakan dan urutan dosis dengan dosis tengah seperti tertera pada Tabel
1.

3. Larutan sampel

Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel. Pada hari penetapan,
siapkan larutan persediaan serta enceran larutan sampel setiap antibiotik dengan
pengencer akhir yang sama seperti untuk baku pembanding seperti tertera pada
Tabel 1. Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer akhir untuk
mendapatkan dosis setara dengan dosis tengah larutan baku (S3).

4. Inokula

Suspensikan mikroba uji dari biakan segar agar miring atau biakan lain dalam
3 mL salin LP steril. Butiran kaca dapat digunakan untuk memudahkan
pembuatan suspensi. Sebarkan suspensi ke permukaan lapisan dari dua atau
lebih lempeng agar atau permukaan media agar dalam botol Roux (menutupi
seluruh permukaan) yang berisi 250 mL media seperti tertera pada Tabel 2.
Inkubasi selama waktu dan suhu tertentu seperti tertera pada Tabel 1, atau
hingga pertumbuhan terlihat jelas.
Tabel 2

\
Setelah inkubasi, mikroba uji dipanen dari biakan lempeng agar atau botol Roux
dengan lebih kurang 50 mL salin LP steril menggunakan batang kaca bengkok

steril atau butiran kaca steril. Suspensi dipipet ke dalam wadah kaca steril, dan
disebut suspensi persediaan. Encerkan sejumlah suspensi persediaan dengan salin
LP steril, ukur transmitan pada panjang gelombang 580 nm menggunakan
spektrofotometer UV-Visibel. Target nilai transmitan lebih kurang 25% pada
panjang gelombang 580 nm. Nilai ini digunakan untuk membakukan volume
suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam lapisan agar inokula.
Dimulai dengan volume yang tertera pada Tabel 2, penentuan proporsi dari
suspensi persediaan yang ditambahkan ke dalam media inokula yang
menghasilkan diameter zona hambatan yang memuaskan lebih kurang 14-16 mm
pada dosis tengah baku (S3) dilakukan selama verifikasi metode. [Catatan
Ukuran zona diluar kisaran 11-19 mm tidak diinginkan, karena dapat menambah
variabilitas penetapan.] Jika transmitan pengenceran diatas 25%, untuk
menormalkannya dengan meningkatkan perbandingan mikroba uji pada lapisan
inokula. Faktor normalisasi ditentukan dengan membagi transmitan yang
diperoleh dari pengenceran dengan 25. Perbandingan ini kemudian dikalikan
dengan jumlah inokula yang disarankan untuk memperoleh volume (mL) dari
suspensi persediaan yang dibutuhkan untuk ditambahkan ke dalam lapisan
inokula. Jika diperlukan, sesuaikan jumlah inokula berdasarkan perhitungan
harian untuk memperoleh hubungan dosis–respons yang optimum. Cara lain,
selama verifikasi metode tentukan bagian suspensi persediaan yang akan
dimasukkan sebagai inokula, dimulai dengan volume seperti yang tertera dalam
Tabel 2, yang hasilnya memenuhi batas zona hambatan dengan diameter 14- 16
mm pada dosis tengah baku (S3), dan memberikan suatu hubungan dosis –
respons yang reprodusibel. Siapkan inokula dengan menambahkan sejumlah
suspensi persediaan ke dalam media agar yang telah dicairkan dan didinginkan
hingga suhu 45 sampai 50 oC, putar campuran tanpa menimbulkan gelembung
hingga diperoleh suspensi homogen.

5. Analisis

Siapkan terlebih dahulu media agar. Media yang digunakan terdapat pada
tabel 3 yaitu media 11 dengan volume target 21 mL
Tabel 3

Biarkan media memadat membentuk lapisan dasar rata dengan ketebalan

seragam. Siapkan sejumlah inokula sesuai lapisan inokula pada Tabel 5 sesuai
dengan antibiotik seperti yang tertera pada Tabel 2 dengan memperhitungkan
berdasarkan pada uji pendahuluan. Putar lempeng ke depan-belakang untuk
menyebarkan inokula di atas permukaan lapisan dasar, dan kemudian biarkan
memadat.
Jatuhkan 6 buah silinder pada permukaan yang telah diinokulasi dari
ketinggian 12 mm, menggunakan alat mekanik atau alat lain untuk menjamin
penempatannya pada radius 2,8 cm, kemudian tutup cawan untuk mencegah
kontaminasi. Isikan keenam silinder pada tiap lempeng dengan enceran
antibiotik dengan tingkat dosis (S1 – S5 dan U3) seperti yang tertera dalam
bab berikut. Inkubasi lempeng seperti tertera pada Tabel 6 selama 16-18 jam,
kemudian seluruh silinder dikeluarkan dari lempeng. Ukur dan catat diameter
antar zona hambatan pertumbuhan mendekati 0,1 mm.
Baku (S1–S5) dan tingkat dosis tunggal sampel U3 yang sesuai dengan S3
 kurva baku seperti tertera pada Penyiapan Baku dan Penyiapan Sampel Uji
yang akan digunakan untuk penetapan. Untuk memperoleh kurva baku, isi
silinder selang-seling pada tiap tiga cawan dengan dosis tengah baku (S3) dan
tiap silinder dari sembilan silinder sisanya dengan satu dari empat
pengenceran larutan baku. Lakukan hal yang sama untuk tiga pengenceran
baku lainnya. Untuk sampel, isi silinder selang-seling pada tiap tiga cawan
dengan dosis tengah baku (S3) dan sembilan silinder sisa dengan enceran
larutan sampel yang sebanding (U3).

6. Perhitungan

Pendahuluan: Potensi antibiotik dihitung dengan menginterpolasikan dari

suatu kurva baku dengan menggunakan metode garis lurus yang telah di
transformasi menjadi bentuk log, dengan prosedur penyesuaian kuadrat
terkecil.
a. Penetapan cara lempeng: Bab ini menjelaskan analisis data sampel dan
penetapan potensi dari data sampel yang tidak diketahui dengan
menggunakan Penetapan cara lempeng.
Langkah 1: Lakukan penghitungan awal dan periksa kesesuaian variasi.
Untuk setiap tiga lempeng, rata-ratakan sembilan nilai pembanding dan
sembilan nilai baku. Untuk kriteria kesesuaian variasi, setiap laboratorium
harus menetapkan nilai keberterimaan maksimum untuk simpangan baku
relatif. Jika ada dari 8 simpangan baku relatif (4 untuk pembanding dan 4
untuk baku) melebihi nilai maksimum yang telah ditetapkan, maka data
penetapan yang tidak sesuai harus dibuang. [Catatan Batas yang
dianjurkan untuk simpangan baku relatif adalah tidak lebih dari 10%.]
Langkah 2: Lakukan koreksi variasi lempeng ke lempeng. Koreksi ini
diterapkan untuk merubah hasil pengukuran rerata zona dari tiap dosis ke
nilai yang hanya bisa jika hasil pengukuran rerata dosis pembanding dari 3
 lempeng sama seperti nilai angka koreksi yang dihitung dengan rumus.
Langkah 3: Penentuan garis kurva baku, buatlah garis kurva baku dengan
menempatkan titik-titik hasil koreksi pengukuran zona terhadap nilai log
dosis baku. Hitung persamaan garis kurva baku dengan menerapkan garis
regresi linear (unweighted linear regretion), menggunakan perangkat lunak
yang sesuai atau penghitungan manual pada Lampiran 1. [Catatan
Gunakan log natural atau log 10 untuk menggambar kurva baku dan
tentukan persamaan regresinya, keduanya memberikan hasil yang sama.]
Tiap laboratorium harus menentukan nilai minimum koefisien determinasi
(%R2) untuk regresi yang dapat diterima. Regresi dapat diterima hanya jika
perolehan %R2 melebihi nilai yang ditentukan. [Catatan Batas minimum
koefisien determinasi disarankan tidak kurang dari 95%.]

b. Penentuan potensi sampel: Untuk menghitung potensi sampel yang tidak

diketahui, rata-ratakan ukuran zona baku dan zona sampel pada tiga
lempeng yang digunakan.
 Bagan Prosedur Kerja Uji Potensi Antibiotik Gentamisin

Ditetapkan pengujian yang sesuai dengan antibiotik gentamisin yaitu

“metode lempeng”

Disiapkan alat uji yang sudah disterilkan

Disiapkan mikroba yang akan digunakan untuk pengujian pada media agar

Disiapkan larutan baku Dapar D3 dan larutan sampel yang berisi Gentamisin.

Disiapkan cawan petri yang berisi media yang akan digunakan (berikan tanda
untuk meletakkan silinder uji), kemudian inokulasikan mikroorganisme uji yang
sensitif terhadap antibiotic secara merata

Disiapkan silinder yang akan digunakan,kemudian tetesi Gentamisin yang akan

diuji pada cawan petri

Keenam silinder diletakkan pada tiap tanda yang pada cawan petri

Inkubasikan pada suhu 36-37,5 oC dan waktu16-18 jam

Hitunglah zona hambat yang terbentuk

Daftar Pustaka
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. 2020. Farmakope Indonesia Edisi VI.
Jakarta: Kementrian Kesehatan RI