ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA

Topik 1: ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA
SECARA HAYATI
Potensi Antibiotika :
Adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat
atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya
dalam IU/mg atau ug/mg
Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi

merupakan metode penetapan hayati, sebagai jasad
renik digunakan mikroorganisme.
Sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah

diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.
Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA
SECARA HAYATI
Prinsipnya:
Adalah membandingkan respon dari mikroba uji yang
peka dalam kondisi percobaan yang sama terhadap zat
baku standar dan zat uji.
Sebagai zat baku standar digunakan zat/senyawa yang

telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA
SECARA HAYATI
Respon yang diamati :
Adalah berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan

mikroba uji yang ditunjukkan oleh daerah bening
(inhibition zone) di sekeliling zat uji (Cara Difusi)
atau kekeruhan (turbiditas) yang ditimbulkan oleh

pertumbuhan mikroba dalam medium cair (Cara
Turbidimetri).

Cara Analisis :
Analisis potensi antibiotika yang dilakukan selama ini

dapat dikelompokkan atas 2 bagian yaitu
1. Cara Difusi Agar (Cara Lempeng)
Prinsipnya, yaitu zat yang akan diuji berdifusi dari pencadang (reservoir)
ke dalam medium agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.
Inkubasi selama waktu tertentu dan kemudian diamati adanya hambatan

pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter hambatannya.
Diameter hambatan yang terbentuk

dibandingkan dengan diameter
baku standar

2. Cara Turbidimetri (Cara Tabung)
Dengan cara ini digunakan media cair, hambatan

pertumbuhan mikroba uji diukur dengan menentukan
kekeruhan (turbiditas) larutan dengan suatu alat yang
cocok, misalnya spektrofotometer.

Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam
analisis potensi antibiotika:
1. Mikroba Uji
- Mikroba uji yang digunakan harus berasal dari galur

murni
- Dapat memberikan respon yang bertingkat antara

peningkatan konsentrasi dengan peningkatan daerah
hambatannya.
- Untuk penetapan dengan cara difusi, daerah hambatan

yang terbentuk harus jelas dan mudah diukur,
- Untuk penetapan cara tabung (turbidimetri) perbedaan

kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas.

Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam
analisis potensi antibiotika:
2. Baku Pembanding Biologi
Sebagai baku pembanding biologi (biological reference)

digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurniaan
dan potensinya secara pasti.
Baku pembanding ini direkomendasi oleh Badan

Kesehatan Dunia (WHO) dan di Indonesia melalui Badan
POM RI (SBI, SPI, SBN, SPN, SBL)
Baku ini diberikan dalam bentuk baku sekunder atas

permintaan laboratorium-laboratorium penelitian atau
Perguruan Tinggi.

3. Media Perbenihan
Media perbenihan yang digunakan harus

mendukung pertumbuhan mikroba uji atau
dapat menumbuhkan mikroba uji dengan baik.
Media perbenihan tidak boleh mengandung zat yang

bersifat antagonis ataupun mempengaruhi aktivitas
antimikroba dari antibiotika yang diperiksa.
Di pasaran banyak ditemui media perbenihan dengan

berbagai merek dengan kode Antibiotic Medium No. 1, 2,
3 dan sebagainya.

4. Larutan Dapar
Digunakan untuk melarutkan antibiotika yang akan

diperiksa,
baik baku pembanding maupun sampel uji.
Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan

dengan sifat dan stabilitas bahan yang akan diuji.

Pemilihan terhadap metode
Pemilihan metode mana yang akan dipakai pada penetapan

potensi antibiotika, apakah cara difusi atau cara tabung
tergantung pada pengalaman yang dimiliki dan fasilitas
laboratorium yang ada.
Akan tetapi untuk zat-zat tertentu pemilihan tidak dapat

dilakukan sekehendak hati, karena sifat bahan yang akan diuji
tersebut.
Misalnya tirotrisin karena difusinya yang jelek tidak akan

memberikan hasil yang memuaskan bila menggunakan cara
difusi,
sebaliknya sefaloridin dengan cara tabung tidak cocok bila

sampel mengandung hasil urainya yang menyebabkan sampel
tetap keruh pada berbagai tingkat pengenceran.

Kelebihan dan kekurangan
dari kedua metode
1. Cara turbidimetri, biasanya mempunyai range daerah

pengerjaan yang sempit dengan perbandingan tingkat
dosis kurang dari 5 : 1.
Sebaliknya pada cara difusi, range tersebut lebih lebar
sehingga dimungkinkan perbandingan tingkat dosis
sampai 100 : 1.
2. Cara turbidimetri, hanya memerlukan waktu inkubasi

kurang dari 4 jam, sedangkan cara difusi memerlukan
waktu paling kurang 18-24 jam.

Kelebihan dan kekurangan
dari kedua metode
3. Cara turbidimetri adalah mengukur aktivitas total dari

antibiotika yang diuji, sedangkan cara difusi tergantung
pada kecepatan difusi zat aktif, sehingga ada
kemungkinan tidak mengukur aktivitas
totalnya.
4. Cara turbidimetri tidak dipengaruhi oleh sifat

difusibilitas dari zat aktif, sedangkan cara difusi sangat
dipengaruhi oleh hal lain tersebut.

Disain Analisis Potensi Antibiotika
Dalam penentuan potensi antibiotika secara mikrobiologi,

disain percobaan yang digunakan tergantung pada
ketepatan hasil yang diinginkan.
Biasanya digunakan tiga tingkat dosis , baik untuk

sediaan uji maupun pembanding.
Pengulangan dilakukan masing-masing 2-8 kali untuk cara

difusi dan 2-6 kali untuk cara turbidimetri.
Pada penetapan rutin seperti Laboratorium Kontrol

Kualitas Obat Pemerintah, biasanya dipakai susunan
dosis 3 : 3 tersebut.
Tingkat dosis yang berdampingan harus tetap, misalnya

2 : 1 atau 4 : 3.
METODE DIFUSI AGAR
Metode analisis potensi antibiotioka dengan cara

difusi agar merupakan cara yang sederhana dan hasil yang
diperoleh cukup teliti.
Cara ini merupakan cara terpilih (selected method) dan

direkomendasi oleh International Collaborative Study di Swedia
dan Food and Drug Administration di Amerika Serikat untuk
pengujian mutu antibiotika.
Prinsip penetapannya, yaitu mengukur luas hambatan

pertumbuhan mikroba uji yang disebabkan oleh zat baku standar
dan zat yang diuji.
Dalam range konsentrasi tertentu, terdapat hubungan yang linier

antara peningkatan konsentrasi dengan luas daerah hambatan
pertumbuhan mikroba uji.

Faktor yang dapat mempengaruhi luas daerah
hambatan dengan cara difusi-agar :

Faktor yang dapat mempengaruhi
luas daerah hambatan dengan
cara difusi-agar :
1. Ingredien Medium Pertumbuhan
Komposisi ingredien yang umum terdapat pada medium pertumbuhan

mikroorganisme adalah :
- pepton - agar
- tripton - mineral
- ekstrak ragi
Banyak mineral yang dapat mempengaruhi aktivitas antibiotika,

misalnya kalsium, magnesium dan besi akan mempengaruhi sensitifitas
pertumbuhan daerah hambatan yang dihasilkan oleh tetrasiklin dan
gentamisin.
Natrium klorida mengurangi aktivitas antibiotika golongan

aminoglikosida dan menambah aktivitas fersidin.
Karbohidrat pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin

atau ampisilin.

2. Pemilihan Medium Pertumbuhan
Untuk memperoleh hasil yang tetap dan reprodusibel,

diperlukan persiapan medium yang cocok bagi pertumbuhan
mikroorganisme,
demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata pada

medium agar.

3. Pengaruh pH
Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan

disebabkan oleh aktivitas antibiotika yang tergantung
pada pH medium.
Aktivitas antibiotika golongan aminoglikosida diperkuat

dalam suasana asam, sedangkan aktivitas tetrasiklin
berlaku sebaliknya.
Gas karbondioksida yang ada alam atmosfir dapat pula

menambah keasaman larutan atau medium yang
digunakan pada penetapan.

4. Ukuran Inokulum
Luas daerah hambatan akan semakin kecil, jika inokulum

semakin besar kandugnan mikroorganismenya.
Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan

mikroorganisme homogen.
Akibat pertumbuhan yang rapat dapat menyebabkan terjadinya

penumpukan pada tempat-tempat tertentu.

5. Stabilitas Mikroorganisme
Resistensi mikroorganisme terhadap suatu antibiotika dapat

terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu.
Oleh sebab itu regenerasi mikroorganisme perlu dilakukan

secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan
kepekaannya.

6. Aktivitas Antibiotika
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik dalam suatu

penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat
minimum (Minimal Inhibition Concentration) dari antibiotika yang
akan diuji.
Pengaruh pre-difusi larutan antibiotika yang terjadi sebelum

inkubasi, harus dihilangkan atau dikurangi dengan tekhnik
pengisian larutan antibiotika ke dalam medium agar.

7. Waktu Inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal,

sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotika dengan
daya tumbuh mikroorganisme dapat menghasilkan daerah
hambatan yang baik bagi pengukuran.

Cakram (Reservoir)
pada cara difusi agar
Cakram : Adalah tempat meletakkan sampel antibiotika yang akan

dianalisis potensinya di atas medium agar yang telah memadat.
1. Silinder gelas/logam
Silinder gelas/logam tahan karat dengan diameter 6-8 mm dapat

digunakan sebagai pencadang antibiotika.
Keuntungan:
Jumlah larutan antibiotika dalam silinder dapat diperbanyak untuk
menjamin ketersediaan antibiotika dalam cadangan selama waktu
inkubasi sesuai dengan daya tampung silinder.
Diameter hambatan yang terbentuk, semata-mata hanya disebabkan

oleh difusi antibiotika selama masa inkubasi.
Kerugian:
Adalah sukar mengatur kedalaman silinder secara manual, sehingga
difusi yang terjadi ada kemungkinan tidak homogen yang ditunjukkan
oleh diameter hambatan yang tidak merupakan lingkaran.

2. Cakram Kertas (Paper Disc)
Dengan menggunakan cakram kertas ini, jumlah larutan

antibiotika yang diserap dapat diatur homogen sesuai dengan
kapasitas dan daya serap kertas, tgt pada diameter dan
ketebalan cakram.
Akan tetapi bila komposisi kertasnya kurang baik,

maka dapat berpengaruh terhadap difusi zat uji sehingga
diameter hambatan yang terbentuk akan bervariasi.

3. Cetak Lobang (Punched Holes)
Dapat dilakukan dengan melobangi medium agar yang
telah diinokulasi dengan alat pengisap agar.
Keuntungannya:
Jumlah larutan antibiotika yang berdifusi dapat terukur
jumlahnya dan medium yang digunakan tidak terlalu
tebal.
Kerugiannnya:
Lobang yang terbentuk sering kurang sempurna
akibatnya juga akan mempengaruhi difusi zat uji.

Susunan Dosis untuk analisis :
1. Untuk Susunan Dosis 2 : 2
Baku Sampel-1 Sampel-2
Dosis Tinggi s2 (5) u2 (1) z2 (3)

Dosis Rendah s1 (6) u1 (2) z1 (4)
2. Untuk Susunan Dosis 3 : 3
Baku Sampel
Dosis Tinggi s3 (4) u3 (1)
Dosis Menengah s2 (5) u2 (2)
Dosis Rendah s1 (6) u1 (3)
Posisi masing-masingnya dalam cawan Petri dapat

dilakukan secara
acak Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt
Prosedur Uji Potensi Antibiotika
Menurut Farmakope Indonesia Edisi 3 (1979) :
Penetapan potensi dengan cara difusi dilakukan dengan

cara sebagai berikut :
Dituangkan inokulum tertentu sejumlah diperlukan ke

dalam cawam Petri atau suatu lempeng bujur sangkar
hingga tebal inokulum 3 sampi 4 mm.
Dasar cawan Petri atau lempeng harus rata dan letaknya

horizontal supaya inokulum sama tebalnya. Biarkan pada
suhu kamar selama 30 menit.
Jika digunakan cawan Petri, 6 silinder besi tahan karat

atau kaca porselin dengan diameter luar 8 mm, diameter
dalam 6 mm dan tinggi 10 mm, dijatuhkan ke permukaan
inokulum.
Jarak antara titik tengah silinder dengan yang lainnya
lebih kurang 28-30 mm.
Silinder diisi dengan larutan pembanding dan sediaan uji

dengan susunan dosis 3:3
sedemikian rupa hingga letak silinder yang berisi larutan

pembanding dan sediaan uji harus berselang-seling.

Begitu juga halnya dengan dosis tinggi, dosis menengah
dan dosis rendah.
Jika menggunakan lempeng bujur sangkar 36 silinder

dijatuhkan ke permukaan inokulum hingga tiap deret dan
kolom terdapat masing-masing 6 silinder.
Silinder diisi dengan larutan pembanding dan sediaan uji

dengan susunan dosis 3:3 sedemikian rupa hingga tiap
dosis harus terdapat pada setiap deret dan kolom.
Biarkan cawan Petri atau lempeng pada suhu kamar

selama 2 jam
Kecuali dinyatakan lain, inkubasi pada suhu 30-35oC

selama 16-18 jam.

Setelah masa inkubasi selesai, diangkat silinder, ukur
dengan seksama diameter daerah hambatan sampai 0,1
mm.
Hitung potensi menurut pola blok rawu untuk cawan Petri

dan kuadrat latin untuk lempeng bujur sangkar.
Perhitungan potensi dengan pola blok rawu, yaitu dengan

cara menentukan berbagai variasi blok dari hasil
pengukuran diameter daerah hambatan untuk
menentukan harga rasio potensi dan batas kepercayaan
rasio potensi.

Prosedur Metode Analisis potensi
Secara Turbidimetri :
Disiapkan beberapa tabung, sesuai dengan didisain

percobaan yang telah dirancang.
Diisi dengan larutan uji dan larutan pembanding dengan

susunan dosis tertentu dan kemudian ditambahkan
medium cair yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.
Selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 37oC dan diaduk

pada suatu shaker inkubator selama 3-4 jam.
Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba uji dihentikan

segera dengan jalan merendamkan tabung-tabung
tersebut ke dalam penangas air suhu 80oC atau dengan
penambahan larutan formaldehid ke dalam masing-masing
tabung.

Suhu penangas air tidak boleh melebihi 80oC, karena
akan menyebabkan koagulasi protein. Selanjutnya
kekeruhan yang disebabkan oleh pertumbuhan mikroba
uji diukur menggunakan spektrofotometer uv-vis pada
panjang gelombang 530 nm.
Perhitungan potensi sama dengan cara difusi, dalam hal

ini data kekeruhan menggantikan data diameter
hambatan.

Sebanyak 36 tabung ditaruh dalam rak tabung, hingga pada
setiap deret dan kolom terdapat 6 tabung.
Tabung diisi secara acak dengan larutan pembanding dan

sediaan uji sejumlah 0,1 ml dengan susunan dosis 3 : 3
sedemikian rupa sehingga tiap dosis terdapat dalam setiap
deret dan kolom. Ditambahkan pada setiap tabung masing-
masing 0,9 ml inokulum.
Siapkan dua tabung blanko, pada satu tabung tuangkan 10 ml

inokulum dan pada tabung yang lainnya tuangkan 10 ml
inokulum dan 0,5 ml larutan formaldehid P.

Inkubasi dalam tangas iar suhu 37±0,5oC selama 3-4 jam.
Setelah inkubasi pada masing-masing tabung, kecuali tabung
blanko, tambahkan masing-masing 0,5 ml larutan formaldehid P.
Selanjutnya dengan menggunakan spektrofotometer, ukur

transmittan pada panjang gelombang 530 nm terhadap blanko
tabung yang berisi inokulum dan larutan formaldehid P.
Hitung potensi dengan cara Biometri.

Faktor yang harus diperhatikan pada penentuan
potensi antibiotika dengan cara turbidimetri:
1. Gunakan tabung-tabung dengan ukuran dan ketebalan

yang seragam sehingga rambatan panas yang
diterimanya juga sama.
2. Medium perbenihan yang telah diinokulasi hendaknya

didinginkan sebelum dimasukkan ke dalam tabung.
3. Gunakan bejana inkubasi/shaker incubator dg

kapasitas yang memadai, sehingga tabung-tabung
dapat diaduk dengan kapasitas yang sama.

4. Pertumbuhan mikroba uji diakhiri pada waktu yang
sama.
Bila menggunakan panas, pakailah penangas air yang

besar dengan suhu 80Csehingga rak tabung dapat
dicelupkan secara sempurna pada waktu yang sama.
Bila menggunakan formalin, sebelum pemberian

formalin rak tabung diangkat dari bejana inkubasi,
lalu dicelupkan ke dalam air es, baru kemudian
diberikan formalin.

Kurva Dosis-Respon pada penentuan
potensi antibiotika dengan cara turbidimetri:
Kurva antara dosis dan respon yang diberikan
umumnya linier pada range dosis tertentu.
Dosis kerja harus dipilih pada daerah linear ini.
Sebelum analisis harus ditentukan kurva ini dulu

untuk pemilihan
dosis yang tepat.
Kurva diplot konsentrasi sel = transmittan sebagai

sumbu y dan log dosis pada sumbu x

Tabel 1: Hasil Pengukuran Diameter Hambatan Pertumbuhan Mikroba
Uji Terhadap antibiotika Rimfapisina dan Baku Pembanding
No. Diameter Hambatan ( mm/10) Jumlah

Blok
Baku (S) Uji (U)
S-1 S-2 S-3 U-1 U-2 U-3
1. 152 166 172 149 162 174 975
2. 152 164 176 152 163 172 979
3. 148 162 170 140 161 170 959
4. 147 163 172 142 164 170 968
5. 150 164 180 146 159 179 978
6. 149 163 171 148 162 174 957
898 982 1041 885 971 1039

Jumlah Respon dan kontras adalah sebagai berikut:
Sediaan Baku Sediaan Uji Jumlah

S U
Dosis rendah 898 885
Dosis menengah 982 971
Dosis tinggi 1041 1039
Jumlah sediaan S = 2921 U = 2895 Y = 5816

Kontras linear Ls = 143 Lu = 154 L = 297
Kontras kuadrat Qs = -25 Qu = -18 Q = -43
S = S1 + S2 + S3 U = U1 + U2 + U3
Ls = S3 – S1 Lu = U3 – U1
Qs = S1 – 2S2 + S3 Qu = U1 – 2U2 + U3
 1). Perhitungan Rasio Potensi
I = log 4/3 = 0,1249
ΣL = Ls + Lu = 297
b = ΣL / (d-1) Inh
= 297 / (3-1) x 0,1249 x 6 x 2 = 99,079
Ys = S / nd = 2921 / 6 x 3 = 162,277
Yu = U / nd = 2895 / 6 x 3 = 160,833
M‘u= Yu – Ys / b = -0,014574
Ru = anti log M‘u = 0,9669
Rasio potensi 96,69% terhadap pembanding diketahui potensi

pembanding Badan POM 985 UI/mg.
Didapatkan potensi rimfapisina sebesar 952,39 UI/mg.

2). Nilai koreksi
K = Y2 / n = (5816)2 / 36 = 939607,111
3). Nilai jumlah kuadrat

Sediaan = S2 + U2 _ K = 18,73
d–n
(Ls  Lu) 2
Regresi (E)   3675 , 375
2 n  h
2 2
Ls  Lu
Kesejajara n   E  5 , 041
2 n
(Qs  Qu) 2
Kuadrat (Kd)   25 , 681
6n - h
Qs 2  Qu 2
Beda kuadrat   Kd  0 , 681
6 n
S 2  S 2  S 2  U 2  U 2  U 2
Perlakuan  4 2 0 1 2 0  K  3725 , 563
n
Jumlah   (V 2 )  K
 (152 2  152 2  148 2  .......  172 2 )  K  4154 , 895
R 2  R 2  R 2  R 2  R 2  R 2  K
Blok  1 2 3 4 5 6
k
(975 2  979 2  .......  967 2 )  939607 , 111


3 x 2
 73,563
Deviasi  Kuadrat Jumlah - (perlakuan  blok)  155,75

Analisis Variansi
Sumber Variansi Derajat bebas Jumlah Kuadrat F P

kuadrat rata-rata
Sediaan h–1=1 18,75 18,75 - -

Regresi 1 3675,375 3675,375 589,948 0,05
Kesejajaran h–1=1 5,041 5,041 0,809 0,05
Kuadrat 1 25,681 25,681 4,122 0,05
Beda kuadrat h–1=1 0,681 0,681 0,109 0,05
Perlakuan k–1=5 745,113 745,113
Blok n–1=5 14,713 14,713 2,362 0,01
Deviasi 25 6,23 6,23
35 3984,875
Keterangan: F =nilai yang didapat dari rata-rata tiap variabel yang diuji.
dinyatakan sebagai rasio terhadap s2 (jumlah kuadrat rata-rata
deviasi)
P =probalitas
4). Batas Keyakinan Rasio Potensi
C 8 t  2,06
3
E 3675,375
C 
(E - s t ) (3675,375  (6,23) 2 (2,06) 2
2 2
 1,04691
Ao  anti log C.M'  (C - 1) (C.M. 2  C.I 2

 anti log - 0,0320998 dan anti log 0,0027223
 0,9287 dan 1,0062
Batas keyakinan rasio potensi 0,9287 - 1,0062

Batas keyakinan ini 96,14% - 104,04% dari rasio potensi yang diperoleh pada penetapan.
Keterangan Simbol
b = slop regresi respon logaritma dosis semua sediaan
c = koefisien evaluasi batas keyakinan (dafrar 45-1)
d = banyaknya ragam dosis tiap sediaan
h = banyaknya sediaan termasuk sediaan pembanding
k = banyaknya ragam perlakuan banyaknya pengadaan tiap perlakuan
s2 = varian
t = koefisien student (daftar 2-1)
C = koefisien dalam perhitungan batas keyakinan
E = kuadrat jumlah regresi
I = interval log dosis yang berdampingan
K = koefisien korelasi dalam analisis varian

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Topik 1: ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA

Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi

Sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah

Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt

Sebagai zat baku standar digunakan zat/senyawa yang

Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt

Respon yang diamati :

Adalah berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan

atau kekeruhan (turbiditas) yang ditimbulkan oleh

Prof. Dr. Akmal Djamaan, MS, Apt