STANDARISASI DAN PENENTUAN MARKER OBAT BAHAN ALAM

TM 9

TEKNIK SAMPLING DAN

MAKROSKOPIS - MIKROSKOPIS

TIM DOSEN STANDARISASI & PENENTUAN MARKER OBA 2020

PENGAMBILAN
SAMPLING
 Pendahuluan
 Sample bahan alam :
 Dapat berasal dari berbagai sumber dan lokasi
tempat tumbuh
 Adanya perbedaan varietas
 Perbedaan umur tanaman
 Perbedaan masa panen
 Pengambilan sample bahan alam akan menentukan
mutu ekstrak  akan menentukan efek farmakologi
 Perlu memperhatikan faktor – faktor yang mempengaruhi
mutu ekstrak baik parameter non spesifik atau spesifik
 Lokasi Tumbuh
 Bahan tumbuhan yang digunakan dalam standarisasi
simplisia maupun ekstrak untuk pengujian dapat diambil
dari 3 tempat yang ketinggiannya berbeda:
 Dataran tinggi
 Dataran sedang
 Dataran rendah
 Tujuan :
 diperoleh hasil rata-rata dari 3 tempat yang hasil
kadarnya setiap tanaman tidak terlalu rendah dan
tidak terlalu tinggi  selanjutnya dibandingkan pada
buku Acuan (Persyaratan kadar tiap monografi
tanaman
 Mencari kadar atau nilai rendemen terbaik untuk
mengetahui tempat tumbuh yg paling baik bagi
tanaman tsb  menghasilkan metabolit sekunder dg
maksimal
 PENGUMPULAN SAMPEL
1. Pastikan spesies dan varietas yang akan diambil
2. Apakah tanaman budidaya atau tanaman liar
3. Pastikan bagian tanaman yang akan diambil
4. Waktu memanen
5. Cara memanen : dg tangan atau dg bantuan alat (ada
senyawa kimia yg dpt berinteraksi dg alat yg digunakan utk
memanen/memetik)
6. Simplisia segar / simplisia kering
7. Jika simplisia segar : masukkan dalam alkohol
8. Jika simpisia kering : masuk ke proses pengeringan
• Biasanya varietas digunakan dalam bidang pertanian
dan ditujukan utk pemuliaan tanaman
• Tanaman yg sudah memiliki banyak varietas contoh-
nya tomat, padi, jagung, singkong, mangga, cabai dll
• Pada varietas yg berbeda kandungan senyawa kimia
juga dapat berbeda, contoh : kandungan capsaicin
pada cabai keriting berbeda dg cabai merah besar
• Kandungan senyawa kimia capsaicin dapat berbeda
jika pemberia pupuk juga berbeda
 Bagian Tanaman
• Akar (Radix) : diambil bagian yang berada dibawah tanah.
• Batang (Caulis) : diambil mulai dari cabang pertama sampai
leher akar, dipotong dengan panjang dan diameter tertentu.
• Kulit batang/klika (Kortex), diambil dari batang utama dan
cabang, dikelupas dengan ukuran panjang dan lebar
tertentu dan tidak mengambilnya dengan satu lingkaran
penuh pada batang.
• Kayu (Lignum) diambil dari cabang atau batang, kulit
dikelupas dan dipotong-potong kecil.
• Daun (Folium), diambil daun tua (bukan daun kuning) daun
kelima dari pucuk. Daun dipetik satu persatu secara manual.
 Bagian Tanaman
• Bunga (Flos), dapat berupa kucup, bunga mekar atau
mahkota bunga atau daun bunga, dipetik langsung dengan
tangan.
• Rimpang (Rhizoma), diambil dan dibersihkan dari bulu-bulu
akar, kemudian dipotong melintang dengan ketebalan
tertentu. Dipanen pada saat daun meluruh (layu)
• Buah (Fructus), dapat berupa buah matang, buah muda,
dipetik dengan tangan.
• Biji (Semen), buah dikupas dan biji dikumpulkan dan
dibersihkan, diambil dari buah yang masak.
• Herba adalah bagian tanaman yang berada di atas tanah,
diambil dan dibersihkan.
UJI MAKROSKOPIS DAN
MIKROSKOPIS
 Identifikasi secara makroskopis maupun mikroskopis
dari tanaman obat  untuk menjamin kebenaran dari
simplisia
 Yang diamati :
 Organoleptis,
 Morfologi dan anatomi
 Kandungan kimia yang memberikan warna spesifik
sehingga mudah dideteksi.
 UJI MAKROSKOPIS
 Uji makroskopis dilakukan utk
melihat bentuk morfologi,
ukuran dan warna dari
simplisia  utk melihat
kekhususan bentuk
makroskopis dari simplisia
yang diuji
 Dapat menggunakan alat
bantu kaca pembesar atau
tanpa alat Sumber : Google Image
 Pengamatan Morfologi
 Mengamati :
 bentuk,
 warna
 ukuran
 Co : daun kelor
 Pengamatan morfologi
• Rimpang temulawak
 Bentuk rimpang
 Warna
Pengamatan morfologi
 Pengamatan Morfologi
 Mengamati : bentuk, warna dan ukuran.
 Contoh: Morfologi Biji Anis (Anisi Fructus)
 Nama : Adas manis = Anisi Fructus (Pimpinella
anisum)
 Buah berbentuk tumpukan terbalik
 panjang 2-5 mm, lebar sampai 3 mm,
bertangkai pendek
 warnanya hijau zaitun sampai coklat,
 berambut dan jarang terbagi menjadi
beberapa karpel.
Setiap pericarp mempunyai lima rusuk.
 UJI MIKROSKOPIS
 Pada uji mikroskopis
 Menggunakan alat mikroskop
 derajat perbesarannya disesuaikan
dengan keperluan uji  utk melihat
bentuk anatomi jaringan yang khas.
 Organ tanaman : akar, batang, daun,
bunga, buah, biji, rimpang
 Untuk mencari jaringan yang khas
pada simplisia.
 Organ tanaman secara umum memiliki jaringan
penyusun : jaringan dermal (epidermis), jaringan dasar
(parenkim), jaringan pengokoh (kolenkim dan
sklerenkim), jaringan pengangkut
 Tipe berkas pengangkut umumnya mengacu pada
kelas tanaman dikotil memiliki tipe berkas
pengangkutan terpusat (konsentris), dan pada
monokotil tersebar.
 Pengamatan Anatomi
 Bentuk sel dan jaringan yang diuji berupa :
 Sayatan melintang dan membujur
 Serbuk

 Dari pemeriksaan anatomi pada organ

 Daun : epidermis, hypodermis, parenkim, sklerenkim, xylem,
floem, trikoma, kel.minyak
 Batang : epidermis, hipodermis, sklerenkim, xylem, floem,
berkas pengangkut tipe kolateral.
 Akar : epidermis, eksodermis, parenkim, korteks, floem dan
xylem.
 Rambut penutup
epidermis
Epidermis dan mesofil

Mesofil bagian bawah

Ca ox
Epidermis bawah + stomata
IDENTIFIKASI KANDUNGAN
KIMIA
 Simplisia yang diuji dapat berupa:
 Rajangan
 Serbuk
 Ekstrak
 Sampel ditambahkan dengan pereaksi tertentu dan
reaksi warna yang terbentuk digunakan untuk
pemastian identifikasi.
 ALKALOID

EKSTRAK

Kualitatif Kuantitatif

1. Pereaksi kimia
1. Gravimetri
(warna, endapan, kristal)
2. Kromatografi
2. Titrimetri
3. Spektrometri 3. Spektrometri
 Identifikasi Alkaloid Secara Kualitatif

Reaksi Pengendapan

Dragendorff Endapan merah bata

Meyer Endapan putih

Bouchardat Endapan putih

 Reaksi Pengendapan
Dragendroff Mayer Bouchardart

Warna : Merah Warna :Putih Warna : coklat

 Reaksi Warna

Alkaloid

Warna

H2SO4p HNO3p HClp NaOHp NH4OHp

 Reaksi Kristal
Reaksi Kristal bentuk Kristal

+ pereaksi Kristal Kristal

Padi Jarum Buku Kubus Dandang

 TANNIN
+ gelatin
Penentuan Secara Kualitatif Tannin:
 Larutan + gelatin 0,5% sama banyak,
maka terjadi pengendapan putih
 Larutan + FeCl3 terbentuk warna violet
biru
 Bercak pada KLT, ditunjukkan
memakai uap ammonia dan dilihat dg
sinar ultraviolet atau dg penyemprotan
Lart.FeCl3
+FeCl3
 FLAVONOID
Secara Kualitatif:
 Penambahan pereaksi FeCl3, : warna kehijauan
(turunan katekol), biru ((turunan pirogalol), hitam
biru (galakatekin)
 Reduksi dengan magnesium dan asam klorida p
 warna merah (flavonol, flavanon, flavananol,
xanton).
 ANTRAKUINON
Penentuan Secara Kualitatif:
1. Bercak pada KLT, dapat dideteksi dengan
penyemprotan berisi magnesium asetat 0,5%
dalam metanol dan pemanasan pada 900 C
Terjadi warna-warna khas.
2. KCKT /HPLC: Pemisahan dan pendeteksian
antrakuinon dan glikosida.
3. Turunan antrakuinon (misal: antron, antrasol)
secara rutin digunakan reaksi Borntrager.
 SAPONIN
Saponin adalah senyawa aktif permukaan yang kuat
menimbulkan busa jika dikocok dalam air dan pada
konsentrasi yang rendah sering menyebabkan hemolysis sel
darah merah.
Penentuan Secara Kualitatif :

Metanol 70%,
panaskan 15 menit
Simplisia Filtrat, totolkan
 lanjutan ....
Secara KLT :
 Pengembang (fase gerak): penjenuhan bejana: etil asetat – metanol -
air (77:13:10), dua kali, setiap kali 5 cm. Kemudian dengan kloroform
- metanol (95:5), satu kali 10 cm. Setiap kali selesai pengembangan,
pelat dikeringkan dulu selama 5 menit.
 Cuplikan:
Ekstrak: cuplikan simplisia dididihkan, refluks (1:1) 15 mnt, saring
panas. Voleme campuran ad 100 mL metanol-air (1:1), dinginkan,
tambahkan 2 mL lart, timbal asetat basa (pereaksi), saring. Filtrat
ditotolkan 5 uL berupa bercak atau 10 uL berupa pita.
 Larutan pembanding: 10 mg arbutin, 10 mg hidrokuinon, dan metil
hidrokuinon dilarutkan dalam 10 mL metanol. Ditotolkan 5 uL berupa
bercak dan 10 uL berupa pita.
Lanjutan ....
Deteksi KLT:
1. Larutan gelatin darah (pereaksi) dituangkan pada pelat.
2. Asam fosfomolibdad-anisaldehida (pereaksi)
 GLIKOSIDA
 Penentuan Secara Kualitatif:
1. Secara KLT:
 Cuplikan: Simplisia dididihkan dengan merefluk methanol
air (1:1) selama 15 mnt, saring panas + methanol air
(1:1), dinginkan, tambahkan larutan timbal asetat
(pereaksi), saring. Filtrat, ditotolkan.
 Larutan Pembanding: 10 mg arbutin, 10 mg hidrokuinon
dan metl hidrokuinon dilarutkan dalam 10 mL methanol.
Ditotolkan 5 uL berupa bercak dan 10 uL berupa pita.
Deteksi
1. UV 254 nm. Perhatikan pemadaman fluorrsensi
turunan hidrokuinon
2. Semprot dengan pereaksi kloronil dan berikan
uap ammonia.
 MINYAK ATSIRI
 Penentuan Secara Kualitatif:
1. Identifikasi dengan data Fisika: P20 (Berat jenis),
nD (Indeks Bias), AD (Rotasi Optik).
2. GC
3. Secara KLT
3. Secara KLT:
 Cuplikan: minyak atsiri dilarutkan dalam toluene dg
konsentrasi 1% , cuplikan ditotolkan 3 uL, kecuali minyak
Juniperus & minyak terpentin yg ditotolkan 6 uL.
 Larutan pembanding: 10 uL anetol, linail asetat, 1,8-
sineol, karvon, eugenol, dan 10 mg mentol masing2 di
larutkan dalam 0,1 mL toluene & larutan ditotolkan 5 uL
Deteksi:
a.UV 254 nm. Perhatikan pemadaman fluoresensi
b. Anis-aldehid-asam sulfat (pereaksi) diamkan 5 mnt 
perubahan warna
 KARBOHIDRAT
Penentuan Secara Kualitatif:
 Pereaksi Mollish  cincin ungu
 Pereaksi Luff  endapan merah
 Pereaksi Fehling A dan B  endapan kuning jingga
(karbohidrat)
 Jika dipanaskan dengan asam sulfat dan fenol :
resorsinol, antron, anaftol, timol  semua karbohidrat
pembentukan warna
 Penambahan pereaksi Iod  terjadi warna biru yang
disebabkan oleh komponen amilosa. Amilopektin
memberikan warna lembayung merah.
 Penambahan pereaksi Iod  terjadi warna biru yang
disebabkan oleh komponen amilosa. Amilopektin memberikan
warna lembayung merah.
 Penambahan froroglusinol dalam asam klorida memberikan
warna lembayung merah: Pentosa dan polisakarida
(mengandung pentosa)
 Golongan Karbohidrat tertentu berdasarkan daya mereduksi
tidak khas seperti: lart. Fehling, lart. Benedict, perak nitrat ber-
amonia, asam dinitro-salisilat basa, dsb. Asam askorbat dapat
dibedakan daya mereduksinya sangat kuat seperti reduksi zat
warna 2,6-dichlorofenol-indofenol atau perak nitrat dalam
larutan bersifat asam.
 Secara khusus, kromatografi cair kinerja tinggi
dipakai secara efektif untuk menganalisis campuran
karbohidrat. Gula berbobot molekul rendah dan
polisakarida keduanya dapat dipisahkan dengan
menggunakan kolom dan pengelusi yang cocok.
 GC: memerlukan pembentukan senyawa turunan
seperti asetat atau eter trimetilsilil.
 NMR: telah digunakan untuk pencirian dan
penggolongan fruktan.
 MINYAK LEMAK
Penentuan Secara Kualitatif/Kuantitatif

CHCl3, kocok 2-3 mnt

Simplisia Filtrat, totolkan
 Penetapan Secara Kualitatif

1.Lihat P (Kerapatan), n20 (Indeks bias) yg merupakan

karakteristik Fisika, selain itu, minyak dapat dikenal dg
menentukan titik lunak, bilangan ester, bilangan hidroksil,
bolangan peroksida
2.Penentuan dengan KLT:
Cuplikan: Ekstrak dari simplisia diserbuk 25 mg (biji
lignum, minyak amandel, dll) dikocok dg 1,0 mL kloroform
selama 2-3 menit. Filtrat ditotolkan 2-3 uL membentuk
bercak atau 5 uL membentuk pita.
Larutan minyak: dibuat larutan minyak lemak 1% dalam
kloroform dan masing-masing ditotolkan 1 uL.
 Larutan pembanding: triolein, trilinolein dan trilinolenin
masing2 dibuat larutan 1% dalam kloroform.
 Pengembang (fase gerak): penjenuhan bejana dengan
99-100% asam asetat biang tingkat mutu analitik.
 Deteksi hasil eluasi pada KLT:
a. Uap Iodium (bejana Iodium), bercak coklat
b. Disemprot larutan pati, untuk fiksasi, larutan basah
(bercak biru), lapisan kering (ungu coklat)
c. Asam fosfomolibdat (diamkan 5-10 mnt, panaskan suhu
1050)
d. 2”-7” diklorofluoresein (pereaksi), fluoresensi kuning.
 GOM DAN MUSILAGO
TUMBUHAN
 Bahan kasar (ekstraksi dengan air mendidih), larut
tambahkan etanol sampai 80% terbentuk senyawa
tidak larut: endapan pectin, pati, gom, musilago,
fruktan sedang senyawa yang larut: damar penukar
anion yg terdiri dari: ditahan, fosfat dan asam dan
eluen, monosacharida, oligosakarida.
 Sudah dibahas : merupakan bagian
KARBOHIDRAT
 ASAM AMINO
Penentuan Secara Kualitatif:
1. HPLC merupakan metode yg cepat dan memisahkan
campuran asam amino secara utuh atau sebagai turunannya.
2. GC menguji asam amino dg mengubah menjadi senyawa
turunan yg mudah menguap. Dilakukan dengan membuat ester
dari gugus karboksil & turunan trifluoroasetil dari gugus amida.
3. Hasil dari poin 2 dapat dilanjutkan ke spektrometri massa

Catatan: mengidentifikasi asam D-amino ialah jumlahnya tidak

memungkinkan mengukur rotasi optic seperti asam D-amina
oksidase
5. Pengukuran dengan KLT :
a.Deteksi pd kertas atau pelat KLT : dg penyemprotan
nin-hidrin 0,1% dalam butanol atau etanol, panaskan
1000 beberapa menit, memberikan warna bercak.
b.Pengembang (fase gerak): campuran
1-butanol/asam asetat/air dan fenol yang jenuh air.
c. Penyemprotan 0,1% dalam butanol atau etanol,
panaskan 1000 beberapa menit, memberikan warna
bercak lembayung-biru, beberapa asam amino
memberikan bercak kuning atau hijau.
 PROTEIN
Penentuan Secara Kualitatif:
1.Uji Biuret diberikan oleh protein & senyawa yg mengandung 2
gugus amida yg berhubungan langsung atau melalui atom
nitrogen tunggal atau karbon.
a) Pereaksi terdiri atas tembaga sulfat dalam larutan natrium
hidroksida pekat, hasil positif : ditunjukkan oleh warna merah
jambu atau lembayung.
b) Terjadi pengendapan dg penambahan ion logam berat (raksa
(ll) klorida, perak nitrat, timbal asetat) & larutan garam pekat
(ammonium sulfat, natrium klorida & natrium sulfat)
c) Pereaksi berguna utk peptide kecil didasarkan penggantian
hydrogen dalam gugus NH dg klor, kemudian menguji klor yg
reaktif dg reaksi pati-iodium
Penentuan secara kualitatif ....(lanjutan)
2. KCKT
3. KLT
4. GC, dapat dipakai untuk peptide yg nisbi kecil dg
mengubah menjadi senyawa turunan yg mudah
menguap.