“PEWARNAAN BTA DAN PROSEDUR PENGAMATANNYA”

Ditulis dalam Rangka Memenuhi Tugas Mata Kuliah Mikroskopis

Dosen : Heri Setiyo Bekti, SST., M.Biomed

Oleh :

IA KELOMPOK 3

Sarjana Terapan Teknologi Laboratorium Medis

Nama Anggota :

1. Kadek Dinda Mahaputri Atmaja (P07134220015)

2. Ni Kadek Sri Oktaviari (P07134220016)
3. Zandra Elysia (P07134220017)
4. Ni Luh Putu Sri Eva Manuwati (P07134220018)
5. Anastasia Fernanda Y.S.A.U (P07134220019)
6. Ni Kadek Santika Dewi (P07134220020)

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR 2020/2021

1. PEWARNAAN BTA

Pewarnaan tahan asam adalah tipe pewarnaan differensial lebih dari satu
pewarnaan untuk membedakan suatu mikroorganisme dengan kandungan
dinding sel peptidoglikan serta disusun lebih dari 60% lipid kompleks yang
tahan terhadap dekolorisasi dengan alkohol asam. Bakteri tahan asam memiliki
kandungan senyawa dari peptidoglikan dan lipid kompleks (wax-d) yang
disebut asam mikolat yang membangun struktur dinding selnya, sehingga
menjadi impermeabel terhadap macam-macam prosedur pewarnaan gram.
Bakteri ini dikenal tahan asam sebab bakteri terbentuk resisten terhadap
dekolorisasi dengan alkohol asam. Bakteri yang tergolong tahan asam yaitu ,
dari genus microbacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus
nocardia.(Dewi Ayu,2013)

Pada dasarnya prinsip pewarnaan mycobacterium yang dinding selnya

tahan asam karena mempunyai lapisan lemah atau lilin sehingga sukar
ditembus cat. Oleh pengaruh phenol dan pemanasan maka lapisan lemak dapat
ditembus cat basic fuchsin. Pada pengecatan Ziehl Neelsen setelah BTA
mengambil warna dari basic fuchshin kemudian dicuci dengan air mengalir,
lapisan lilin yang terbuka pada waktu dipanasi akan merapat kembali
karena terjadi pendinginan pada waktu dicuci. Sewaktu dituangi dengan asam
sulfat dan alkohol 70% atau HCI alkohol, warna merah dari basic fuchsin pada
BTA tidak akan dilepas/luntur.Bakteri yang tidak tahan asam akan melepaskan
warna merah, sehingga menjadi pucat atau tidak bewarna. Akhirnya pada
waktu dicat dengan Methylien Blue BTA tidak mengambil warna biru dan
tetap merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan mengambil warna
biru dari Methylien Blue.
Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl
Neelson, Kinyoun Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret
paru-paru atau ludah) untuk analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat
dikenal ada 3 jenis sputum:
 Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat
bangun pagi.

Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.

Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam.

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama
satu minggu.

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat

warna carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada
pemberian warna pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat
mempertahankannya. Carbol fuchsin merupakan fuksin basa yang dilarutkan
dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan warna merah pada sediaan
dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu pemasukan zat warna
ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan untuk
melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk
sewaktu BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat
warna pertama tidak mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air
mengalir untuk menutup pori-pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan
terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri yang tidak tahan asam akan
melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri tidak berwarna.
Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak tahan
asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-

Neelsen dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut
bakteri tidak tahan asam (non acid fast).
 Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan
mempunyai sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan
sensitivitas yang tinggi sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri
yang terwarnai menunjukkan warna yang kontras dengan lingkungannya dan
tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x sehingga bisa mempercepat
waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu mikroskop fluorescens
(Kurniawati et al., 2005).

Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol

fuchsin 0,3%, serta methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai
fungsi antara lain asam alkohol digunakan sebagai peluntur, carbol
fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin agar menjadi lunak sehingga
cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M. tuberculosis. Methylen blue
berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen blue pada bakteri
akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau (Jutono dkk.,
1980).

Standar yang terdapat dalam IUATLD (International Union Against

Tuberculosis Lung Disease) seperti berikut :

- Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA

- Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP
- Positif 1 : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP
- Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP
- Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP
2. PROSEDUR PENGAMATAN

Adapun prosedur pengamatan dalam melakukan pewarnaan BTA.

1. Metode : Zeihl neelsen

Tujuan : Untuk mencari BTA
Prinsip :
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin
dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh
fenol dan pemanasan maka lapisan lilin dan lemak itu dapat
ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian lapisan
lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada
pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas.
Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan
mengambil warna biru dari methylen blue.
- Prosedur Pembuatan Sediaan
• Diambil kaca sediaan yang bersih, bebas lemak dan tidak ada
goresan.
• Disiapkan sebuah kaca sediaan yang diberi tanda ukuran 2X3
cm sebagai pola.
• Diletakkan kaca pola dibawah kaca sediaan.
• Lampu speritus dinyalakan dan ose dipanaskan sampai
membara mulai ujung sampai kepangkal.
• Dengan menggunakan ose steril lalu diambil bagian sputum
yang kental berwarna putih kekuninggan atau putih kehijauan,
lalu diletakkan pada kaca sediaan.
• Sputum diratakan seperti terlihat pada gambar :
• Dimasukkan ose kedalam botol yang berisi pasir dan olkohol
70 %(tinggi alkohol ± 3 cm diatas pasir). Kemudian tangkai ose
digoyangkan pelan-pelan untuk melepaskan sisa partikel sputum
yang melekat pada ose.
 • Letakkan ose berdekatan pada api spiritus, setelah kering
barulah dibakar sampai pijar.
• Keringkan sediaan pada suhu kamar, jangan dikeringkan di atas
nyala api.sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu speritus
sebanyak 3 X selama 3-5 detik.
- Prosedur Pewarnaan
• Letakkan sediaan di atas rak pewarnaan dengan apusan
menghadap ke atas.
• Tuangkan Carbol Fuchsin sampai menutupi seluruh permukaan
kaca sediaan.
• Panaskan kaca sediaan secara hati-hati dengan caara
melewatkan nyala api pada bagian bawah kaca sehingga keluar
uap(jangan sampai mendidih) selama 3 menit.
• Sediaan dibiarkan hingga dinginn selama 5 menit.
• Sediaan dicuci dengan air mengalir.
• Tuangkan asam alkohol 3% di atas kaca sediaan sampai warna
merah dari fuchsin hilang.
• Sediaan dicuci dengann air mengalir
• Tuangkan larutan methylen blue 0,3% diatas sediaan dan
biarkan selama 10-20 detik atau larutan methylen blue 0,1%
selama 1 menit.
• Sediaan dicuci dengan air mengalir dan keringka pada suhu
kamar.
- Prosedur Pembacaan dan Interpretasi Hasil
• Sediaan yang sudah kering diperiksa dibawah mikroskop.
• Teteskan satu tetes minyak emersi diatas sediaan, periksa
dengan okuler 10X dan objektif 100X.
• Carilah basil tahan asaam (BTA) yang berwarna merah dengan
latar belakang biru.
• Periksa paling sedikit 100 lapangan pandang dengan cara
menggeserkan sediaan dari kiri ke kanan atau dari kanan ke
kiripada garis lurus.
• Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan skala
IUATLD sebagai berikut :
1. Tidak ditemukan BTA dalam 100 lapangan pandang : Negatif
2. Ditemukan 1-9 BTA/ 100 lapangan pandang : Ditulis jumlah
kuman yang ditemukan.
3. Ditemukan 10-99 BTA/ 100 lapangan pandang : + (1+)
4. Ditemukan 1-10 BTA/ 1 lapangan pandang : ++ (2+)
5. Ditemukan > 10 BTA/ 1 lapangan pandang : +++ (3+)

2. Metode : Kinyoun Gabbet

Tujuan : Untuk mencari BTA
Prinsip :
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin
dan lemak yang sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh
fenol dan kadar cat yang tinggi maka lapisan lilin dan lemak
itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian
lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali.
Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak
dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur
dan mengambil warna biru dari methylen blue.
Cara Kerja :
• Dibuat sediaan kuman dan difiksasi.
• Diwarnai dengan Kinyoun selama 3 menit
• Sediaan dicuci dengan air.
• Diwarnai dengan Gabbet selama 1 menit.
• Dicuci dan dikeringkan
• Diperiksa di bawah mikroskop.
Sediaan yang telah diperiksa kemudian direndam dengan
xylol selama 15-30 menit, lalu disimpan dalam kotak
sediaan.
Interpretasi hasil : BTA : warna merah dan Non BTA : warna
biru
 DAFTAR PUSTAKA

Hendro. 2012. Bakteriologi. Pewarnaan BTA (Bakteri Tahan Asam)

Diakses dari : http://analisbantul.blogspot.com/2012/09/pewarnaan-bta-
bakteri-tahan-asam.html?m=1

Dwi Anjani. Pewarnaan BTA.Vol hal. 9 halaman

Diakses dari :
https://www.academia.edu/7704555/PEWARNAAN_BTA